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CRISPR für bessere Antibiotika nutzen

Wirkstoffscreening mit Mobile-CRISPRi

15.01.2019

Ein Forscher der University of Wisconsin-Madison und seine Kollegen an der University of California, San Francisco, haben das Gene-Editing-Tool CRISPR neu eingesetzt, um zu untersuchen, welche Gene von bestimmten Antibiotika angesprochen werden, und Hinweise zu geben, wie man bestehende Antibiotika verbessern oder neue entwickeln kann.

Die Resistenz gegen aktuelle Antibiotika durch krankheitserregende Krankheitserreger ist ein wachsendes Problem, das schätzungsweise Millionen von Menschenleben gefährdet und jedes Jahr in den USA über 2 Milliarden Dollar kostet.

"Was wir tun müssen, ist, neue Schwächen in diesen Bakterien herauszufinden", sagt Jason Peters, ein UW-Madison-Professor für Pharmawissenschaften, der das neue System entwickelte.

Die Technik, bekannt als Mobile-CRISPRi, ermöglicht es Wissenschaftlern, die Antibiotika-Funktion bei einer Vielzahl von pathogenen Bakterien zu testen.

Mit einer Form von bakteriellem Sex transferierten die Forscher Mobile-CRISPRi aus gängigen Laborstämmen in verschiedene Bakterien, darunter auch eine kleine Mikrobe, die auf Käserinden zu Hause ist. Diese einfache Übertragung macht die Technik zu einem Segen für Wissenschaftler, die eine beliebige Anzahl von Bakterien untersuchen, welche Krankheiten verursachen oder die Gesundheit fördern.

Peters arbeitete mit Carol Gross, Oren Rosenberg und anderen Kollegen der UCSF und anderen Institutionen zusammen, um Mobile-CRISPRi zu entwickeln und zu testen. Das System reduziert die Produktion von Proteinen aus Zielgenen und ermöglicht es den Forschern zu identifizieren, wie Antibiotika das Wachstum von Krankheitserregern hemmen. Dieses Wissen kann der direkten Forschung helfen, die Resistenz gegen bestehende Medikamente zu überwinden.

Sie nutzten das immer beliebter werdende molekulare Werkzeug CRISPR, aber auf eine einzigartige Weise. "Die meisten Menschen, wenn sie an CRISPR denken, denken an die Genbearbeitung", sagt Peters, der an der UW-Madison promovierte und kürzlich als Assistenzprofessor an die School of Pharmacy kam. "Aber das ist nicht das, was ich tue."

Normalerweise wird das CRISPR-System auf ein Gen ausgerichtet, wo es die DNA in zwei Teile teilt. Das Gen kann bearbeitet werden, während die Zelle den Schaden repariert.

Aber Peters und seine Mitarbeiter arbeiteten mit einer defangedeten Form von CRISPR, bekannt als CRISPRi. CRISPRi wurde entwickelt, um die DNA nicht schneiden zu können. Stattdessen sitzt es einfach auf der DNA und blockiert andere Proteine daran, Zugang zu einem bestimmten Gen zu erhalten und es einzuschalten. Das Ergebnis ist eine geringere Expression des Gens und eine geringere Menge des Proteins, für das es kodiert.

Die Forscher zeigten, dass, wenn sie die Menge des Proteins verringerten, das durch ein Antibiotikum angegriffen wurde, das Bakterium viel empfindlicher auf die niedrigere Dosis des Wirkstoffs wurde - ein Beweis einer Verbindung zwischen Gen und Wirkstoff. Auf diese Weise können Tausende von Genen gleichzeitig als potenzielle Antibiotika-Ziele identifiziert werden, was den Wissenschaftlern hilft, zu lernen, wie Antibiotika wirken und wie sie verbessert werden können.

Um CRISPRi mobil zu machen, entwickelten die Forscher Methoden, um das System von gängigen Bakterienmodellen wie E. coli auf krankheitsverursachende Arten zu übertragen, die oft schwieriger zu untersuchen sind. Peters' Team wandte sich einem der natürlichen Wege zu, wie Bakterien DNA verknüpfen und austauschen, eine Art bakteriellen Geschlechtsverkehr, der als Konjugation bezeichnet wird. Der ehemalige UW-Madison Professor für Genetik Joshua Lederberg entdeckte die Konjugation, die ihm 1958 den Nobelpreis einbrachte.

"Man mischt die Bakterien im Grunde genommen zusammen und es passiert", sagt Peters über die Konjugation. "Nichts ist einfacher als das."

Mit Hilfe von Konjugation transferierte Peters' Team Mobile-CRISPRi unter anderem auf die Krankheitserreger der Stämme Pseudomonas, Salmonella, Staphylococcus und Listeria.

"Das bedeutet, dass man jetzt Studien darüber durchführen kann, wie Antibiotika direkt in diesen Krankheitserregern wirken", sagt Peters. "Das könnte uns einen besseren Hinweis darauf geben, wie diese Medikamente in den verschiedenen Organismen wirken und was wir möglicherweise tun können, um sie zu verbessern."

Der eigentliche Test für die Mobilität von Mobile-CRISPRi war der Käse.

Mit zunehmendem Alter des Käses kuratiert er seine eigene Mikrobenlandschaft. Die Wissenschaftler beginnen gerade erst, die immense Vielfalt an Bakterien und Pilzen an Käse zu untersuchen, die zu ihren komplexen Aromen beitragen. Eines dieser Bakterien, Vibrio casei, wurde 2010 von Peters' Mitarbeiterin Rachel Dutton von der University of California, San Diego, auf der Rinde eines französischen Käses gefunden.

Die Manipulation von Genen ist bei etablierten Laborbakterien wie E. coli einfach, aber es gibt oft keine Möglichkeit, Gene in Bakterien zu untersuchen, die kürzlich aus der Umwelt isoliert wurden, wie z.B. V. casei. Aber Mobile-CRISPRi konnte leicht in den Stamm übertragen werden und eröffnete neue Wege, um zu verstehen, wie sich die Bakterien ansiedeln und den Käse altern lassen. Als Proof-of-Concept schlägt V. casei vor, dass Mobile-CRISPRi für eine beliebige Anzahl von zuvor untersuchten Bakterien nützlich sein sollte, sowohl für diejenigen, die uns schaden, als auch für diejenigen, auf die wir uns verlassen.

Jetzt bietet Peters Mobile-CRISPRi auch anderen Forschern an, ihre Lieblingskeime zu untersuchen.

"Jetzt wird es also der Community vollständig zur Verfügung stehen", sagt Peters. "Das gibt den Menschen einen Weg nach vorne."

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