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Die kleinsten Lebensformen haben das kleinste funktionierende CRISPR-System

Metagenomische Suche ergibt kompaktes Cas-Protein, ideal für die Diagnostik

22.10.2018

Eine alte Gruppe von Mikroben, die einige der kleinsten Lebensformen der Erde enthält, verfügt auch über die kleinste CRISPR-Genbearbeitungsmaschine, die bisher entdeckt wurde.

Die Maschine für kleine Proteine, genannt Cas14, ist verwandt und hat nur ein Drittel der Größe des Cas9-Proteins, dem Endprodukt des revolutionären Gen-Editing-Tools CRISPR-Cas9. Während Cas9 aus Bakterien isoliert wurde, wurde Cas14 im Genom einer Gruppe von Archaea - einem primitiven Verwandten von Bakterien - gefunden, die einige der kleinsten Zellen und kleinsten bekannten Genome enthält.

Cas9 und andere Cas-Proteine sind Teil eines Abwehrsystems, das von Mikroben entwickelt wurde, um sich vor Viren zu schützen. Alle sind gezielte Enzyme, die sehr selektiv nach einer bestimmten DNA oder RNA-Sequenz suchen und an sie binden - in Mikroben, die mit Sequenzen übereinstimmen, die nach früheren Virusinfektionen in ihren CRISPR-Speicherbanken gespeichert sind - und dann die DNA oder RNA schneiden, um den neuen Invasoren zu deaktivieren.

Wie Cas9 hat auch Cas14 Potenzial als biotechnologisches Werkzeug. Aufgrund seiner geringen Größe kann Cas14 bei der Bearbeitung von Genen in kleinen Zellen oder bei einigen Viren nützlich sein. Aber mit seiner einzelsträngigen DNA-Schneidearbeit ist es wahrscheinlicher, dass es die schnellen CRISPR-Diagnosesysteme für Infektionskrankheiten, Genmutationen und Krebs verbessert.

"Für die molekulare Diagnostik wollen Sie in der Lage sein, doppelsträngige DNA, einzelsträngige DNA und RNA gezielt einzusetzen", sagt Lucas Harrington, ein Doktorand der UC Berkeley und Erstautor einer Arbeit, die über die Entdeckung berichtet. "Cas12 ist wirklich gut bei der Erkennung von doppelsträngiger DNA, Cas13 ist wirklich gut bei der Erkennung von einzelsträngiger RNA und jetzt vervollständigt Cas14 das Set: Es ist wirklich gut bei der Erkennung von einzelsträngiger DNA."

Cas14 ist Cas12 und Cas13 ähnlich, da es nach der Bindung an seine Ziel-DNA-Sequenz wahllos beginnt, alle einzelsträngigen DNA innerhalb einer Zelle zu schneiden. Cas9 hingegen bindet und schneidet nur die Ziel-DNA.

Das mutwillige Schneiden von DNA ist ein möglicher Nachteil in der Therapie, aber ein großer Vorteil in der Diagnostik. Das Cas14-Protein kann mit einem Fluoreszenzmarker gekoppelt werden, der an ein Stück einzelsträngiger DNA gebunden ist. Wenn Cas14 an seine Ziel-DNA-Sequenz - ein Krebsgen oder ein Gen in infektiösen Bakterien - bindet und anfängt, DNA zu schneiden, schneidet es auch die mit dem Marker verbundene DNA und erzeugt ein fluoreszierendes Signal.

"Cas14 zielt auf einzelsträngige DNA auf eine viel spezifischere Weise als Cas12", fügte Harringtons Kollegin Janice Chen hinzu, die kürzlich an der UC Berkeley promoviert wurde. "Das war ein wirklich unerwarteter Fund. Weil es so klein ist, dachten wir kaum, dass es funktionieren könnte, aber eigentlich ist es super-spezifisch, was es auch zu einer wirklich leistungsstarken Ergänzung der Diagnosetoolbox macht."

Harrington, Chen und ihre Kollegen, darunter die CRISPR-Cas9-Erfinderin Jennifer Doudna, eine Professorin der UC Berkeley für Molekular- und Zellbiologie und Chemie, haben Cas14 an ihr Diagnosesystem DETECTR angepasst, das nun Cas12 und Cas13 verwendet, um das Vorhandensein von infektiösen Organismen und genetischen Veränderungen schnell zu erkennen. Harrington, Doudna und Chen sind Mitbegründer des Unternehmens Mammoth Biosciences, das DETECTR kommerzialisiert.

Die Gewinnung aus Metagenomen

Das Cas14-Protein wurde von den Mitautoren Harrington und David Burstein, heute Professor an der Tel Aviv University in Israel, gefunden, als sie nach Cas-Varianten in einer Datenbank mit mikrobiellen Genomen suchten, die in den letzten 15 Jahren von ihren Kollegen der UC Berkeley erstellt wurde - einem Team unter der Leitung von Jill Banfield, Professorin für Erd- und Planetenwissenschaften und Umweltwissenschaften, Umweltpolitik und Umweltmanagement. Die Genome, die sich in einer Größenordnung von Zehntausenden bewegen, wurden durch metagenomische Sequenzierung der gesamten DNA in Proben aus einer Vielzahl von exotischen Umgebungen gewonnen. Cas14 wurde im Genom von Archaea gefunden, das aus Grundwasserproben stammt, die aus einer Giftreinigungsstation in Rifle, Colorado, stammen.

Vor zwei Jahren entdeckten Harrington und Burstein andere kleine Cas-Proteine, CasX und CasY, während sie die Metagenomik-Datenbank durchsuchten.

Cas14 ist halb so groß - zwischen 400 und 700 Aminosäuren lang - wie CasX und kleiner als alle anderen bekannten Cas-Systeme, die in der Länge von 950 bis 1.400 Aminosäuren reichen.

"Zufällig haben wir diese sehr kleinen Proteine gefunden, die andere Leute einfach wegwerfen, weil sie nicht wie zuvor bekannte CRISPR-Systeme aussehen. Sie sind zu klein", sagte Harrington. "Wir haben entschieden, was zum Teufel, lass es uns versuchen. Wir haben es ausprobiert und waren eigentlich schockiert, als wir feststellten, dass es sich um echte funktionale Systeme handelte."

Das Gen für Cas14 in der Datenbank zu finden, war nur der Anfang. Die meisten Cas-Proteine wurden bisher in Bakterien gefunden und funktionieren daher gut im Standard-Laborbakterium E. coli. Aber Cas14 kommt aus Archäa - und eine Gruppe der kleinsten der Archäa, DPANN genannt. Alle Cas-Proteine enthalten RNA-Teile für Targeting und Bindung, aber Cas14 funktioniert nicht mit CRISPR-Cas9-RNAs, so dass das Team auch die beiden RNAs aus der Datenbank fischen musste, die vorhanden sein müssen, damit Cas14 funktioniert.

Außerdem kann DPANN Archaea nicht im Labor kultiviert werden - sie scheinen parasitär oder in irgendeiner Weise von anderen größeren Archaea abhängig zu sein - also mussten die Forscher die richtige Umgebung in einem Reagenzglas schaffen.

In Übereinstimmung mit seinen Ursprüngen in einer primitiveren Mikrobe, scheint das verschlankte Cas14 eine primitivere Version der größeren und komplexeren Cas9- und Cas12-Proteine zu sein, sagte Harrington und deutete an, dass sich die Moleküle über die Äonen entwickelt haben, um spezialisierter zu sein. Die Forscher hoffen, von solchen primitiven Cas-Proteinen zu lernen, die die wesentlichen Bestandteile des Cas-Enzyms sind, damit sie die kompaktesten und schlanksten Genschneider entwickeln können, die sie können.

Harrington stellte fest, dass der metagenomische Abbau verschiedene Versionen von Cas14 hervorgebracht hat, die sich als nützliche biotechnologische Werkzeuge erweisen können. "Eine erstaunliche Sache.... ist, wie vielfältig diese Systeme sind", sagte er. "Wir haben mehr als 40 neue CRISPR-Cas14-Systeme und acht verschiedene Subtypen beschrieben. Das öffnet die Türen für die Untersuchung dieser neuen CRISPR-Systeme."

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