Chip zeigt Mutation an

DNA-Chips zur raschen und zuverlässigen Identifizierung von Punktmutationen

20.06.2006

Manchmal sind es nur winzige Unterschiede, die aus einem normalen Gen ein krankes machen können. Ein einzelnes Nucleotid ist beispielsweise ausgetauscht in einem Genabschnitt, der als Oncogen p53 bezeichnet wird - eine Mutation, die in mehr als 50% der beim Menschen bekannten Krebsarten gefunden wird. Solche Einzelpunktmutationen zu identifizieren, ist zwar möglich, bislang fehlt jedoch eine rasche, einfache Routinemethode, die zuverlässig und genau genug arbeitet. Japanische Forscher um Kenzo Fujimoto und Shinzi Ogasawara haben nun einen DNA-Chip zur sicheren Identifikation von Punktmutationen entwickelt. Erfolgsgeheimnis der neuen Methode, die Basis für eine automatisierte Hochdurchsatz-Diagnostik sein könnte, ist eine photochemische Verknüpfung zweier DNA-Fragmente.

Und so funktioniert der Nachweis: Auf einem Chip werden kurze DNA-Einzelstränge fixiert. Diese "Abfangstränge" sind zu dem Abschnitt der zu analysierenden Einzelstrang-DNA komplementär, in dem sich die interessierende Punktmutation befindet. Der besondere Trick: Der Abfangstrang trägt am Ende ein Nucleotid, das chemisch so verändert ist, dass es bei einer späteren Bestrahlung mit UV-Licht reaktiv wird. Nun wird die Probe auf den Chip gegeben. Die Analyt-DNA bindet an den Abfangstrang. Passen die beiden Gegenstücke perfekt zueinander, geht das sehr schnell. Ein einzelnes "falsches" Nucleotid reicht, um die Paarung etwa tausendmal langsamer zu machen, sodass nach Stoppen der Reaktion nur wenige Abfangstränge besetzt sind.

Im Folgeschritt wird ein weiterer kurzer DNA-Einzelstrang zugegeben, der Sondenstrang. Dieser ist zum nächsten Abschnitt der Analyt-DNA komplementär und kann nur dann andocken, wenn Analyt-DNA am Abfangstrang gebunden ist. Nun kommt das UV-aktivierbare Nucleotid ins Spiel: Wird der Chip bestrahlt, reagiert es mit dem benachbarten Ende des Sondenstrangs und verknüpft Abfang- und Sondenstrang fest miteinander. Auch nach dem Abwaschen der Analyt-DNA vom Chip bleibt der so angekuppelte Sondenstrang haften. Die Sondenstränge tragen Biotin, eine Art chemischen "Haken". Im Folgeschritt wird ein Fluoreszenfarbstoff zugegeben, der die dazu passende "Öse" (Streptavidin) trägt. Eine starke Fluoreszenz auf dem Chip zeigt an, dass viele Probe-DNA-Moleküle gebunden hatten, ihre Sequenz damit genau zum Abfangstrang passte. Minimale Fluoreszenz bedeutet sehr langsame Strangpaarung, die Probe-DNA ist verändert.

"Während bereits eine Vielzahl enzymatischer Verknüpfungsmethoden von DNA-Fragmenten entwickelt wurde, sind lichtinduzierte Verknüpfungen bisher selten," sagt Fujimoto. "Ihr Vorteil liegt auf der Hand: Die photochemische Methode kommt ohne zusätzliche Reagentien aus. Vor allem aber kann sie über die Art und Weise der Bestrahlung räumlich und zeitlich sehr genau kontrolliert werden. Derartige Photoligationen können ein wirksames Instrument für das DNA-Design und die Nanotechnologie sein."

Originalveröffentlichung: Kenzo Fujimoto et al.; "SNP Genotyping by Using Photochemical Ligation"; Angewandte Chemie 2006, 118, No. 27, 4624-4627.

https://www.bionity.com/de/news/55649/chip-zeigt-mutation-an.html