Una "horquilla" incorporada impide la aparición de ARN CRISPR no deseados
Un equipo de investigadores descubre un mecanismo de optimización en el sistema CRISPR-Cas13
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El sistema de edición genética CRISPR-Cas es desde hace tiempo objeto de investigación como herramienta prometedora en la edición del genoma. Sin embargo, se ha hecho hincapié en sus mecanismos y nucleasas subyacentes. En cambio, pocas investigaciones han examinado cómo han evolucionado y se han optimizado los sistemas CRISPR-Cas. En colaboración con las universidades de Leipzig, Friburgo y Michigan (EE.UU.), un equipo de investigadores del Instituto Helmholtz para la Investigación de Infecciones Basadas en el ARN (HIRI) de Würzburg descubrió un mecanismo de optimización en CRISPR-Cas13, lo que permite comprender mejor la evolución de estos sistemas. Los resultados se han publicado recientemente en EMBO Journal.
Los sistemas CRISPR-Cas son los únicos sistemas inmunitarios adquiridos conocidos en bacterias. Pueden almacenar información genética de fagos atacantes -virus que infectan bacterias- para combatir futuras infecciones. En las matrices CRISPR, que son secuencias de ADN, un fragmento de ADN del fago atacante se archiva entre dos repeticiones de secuencia fija. Cada fragmento viral produce un ácido ribonucleico CRISPR (ARNcr), que instruye al sistema para reconocer al mismo intruso en caso de un nuevo ataque.
El mecanismo subyacente es complejo y consta de varios componentes que trabajan juntos simultáneamente. Sin embargo, estos componentes pueden interferir entre sí. Por ejemplo, para almacenar una matriz CRISPR, ésta debe empezar y terminar con una repetición. Esto da lugar a una repetición de más en un extremo, lo que produce un ARN CRISPR sin ningún "fragmento viral". "El ARN CRISPR resultante, conocido como ARN CRISPR extraño (ecrARN), es un desperdicio en el mejor de los casos. En el peor de los casos, distrae a la maquinaria CRISPR y le impide buscar virus infecciosos", afirma Chase Beisel, jefe de departamento afiliado al HIRI y miembro de la facultad del Instituto Botnar de Ingeniería Inmunológica de Basilea (Suiza). Beisel inició la investigación, publicada recientemente en EMBO Journal.
Pero la naturaleza tiene una solución: En un estudio de 2022 publicado en Nature Microbiology, Beisel y su equipo demostraron que un tipo de sistemas CRISPR-Cas, que utilizan nucleasas Cas9 para cortar el ADN, pueden impedir la formación de ecrARN introduciendo un ARN adicional aguas arriba de la repetición problemática. "El ARN se une a la primera repetición y se asegura de que no sea reconocida por la maquinaria CRISPR", explica Beisel.
Sin embargo, durante mucho tiempo no estuvo claro si otros sistemas CRISPR-Cas también utilizaban esta solución. Junto con científicos de las universidades de Leipzig, Friburgo y Michigan (EE.UU.), investigadores del Instituto Helmholtz para la Investigación de Infecciones Basadas en el ARN (HIRI), dependiente del Centro Helmholtz de Braunschweig para la Investigación de Infecciones (HZI) en cooperación con la Universidad Julius-Maximilians de Würzburg (JMU), investigaron si los sistemas CRISPR-Cas13 -que se parecen muy poco a los sistemas CRISPR-Cas9- producen ARNecr y, en caso afirmativo, cómo los contrarrestan.
Una solución entre sistemas
"Descubrimos que muchos sistemas CRISPR-Cas13 también utilizan un ARN para evitar la formación de ecARN", explica Angela Migur, antigua investigadora postdoctoral en el laboratorio de Chase Beisel. Con la primera repetición, este ARN protector forma una estructura estable parecida a una horquilla. Esto impide que la nucleasa Cas13 se una a la repetición, la procese y produzca un ARNecr. "La aparición de la 'horquilla' fue inesperada, ya que los sistemas CRISPR-Cas9 y CRISPR-Cas13 evolucionaron de forma independiente y funcionan de forma muy diferente", añade Migur. "Sorprendentemente, sin embargo, los mecanismos que inhibían la formación de ecrARN eran muy similares".
Estas observaciones apuntan a un caso notable de evolución convergente: diferentes sistemas CRISPR-Cas han desarrollado independientemente mecanismos para superar obstáculos comunes en la defensa inmunitaria.
El equipo también descubrió que no todos los sistemas CRISPR-Cas dependen de ese ARN protector. El factor decisivo era si la repetición adicional se producía al principio o al final del conjunto CRISPR. Esta observación sugiere que aún quedan por descubrir otras estrategias distintas que potencien la eficacia de los sistemas CRISPR-Cas.
Nuevas perspectivas de investigación
Las nucleasas Cas13 se utilizan ahora ampliamente como herramientas de investigación y como método no permanente para la edición de genes a nivel del ARN. El descubrimiento del equipo de investigación podría contribuir a aumentar la eficacia de estos sistemas al garantizar que sólo se produzcan los ARN CRISPR previstos. Además, existe la posibilidad de inhibir la defensa viral mediante el sistema CRISPR-Cas utilizando ecrRNAs, haciendo que la herramienta genética sea más fácil de controlar.
Aunque la investigación ya ha realizado enormes esfuerzos para caracterizar los nuevos sistemas CRISPR-Cas, se ha centrado principalmente en los mecanismos fundamentales de la inmunidad adaptativa, en particular en las propiedades de las respectivas nucleasas. Sin embargo, poco se ha investigado hasta ahora sobre cómo se coordinan de forma óptima los componentes individuales de estos sistemas para garantizar que su interacción sea lo más eficiente posible. En este estudio se descubrió un inconveniente de la estructura de los conjuntos CRISPR, que puede remediarse fácilmente con un simple ARN en horquilla. "Esperamos que nuestro trabajo anime a la comunidad investigadora a investigar más a fondo las limitaciones de los sistemas CRISPR-Cas y otros mecanismos de defensa bacterianos. Al mismo tiempo, es importante aclarar qué estrategias han desarrollado estos sistemas para superar esos obstáculos de la forma más eficaz posible", afirma Beisel.
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