Una "forcina" incorporata impedisce agli RNA CRISPR di sbagliare
Un team di ricerca scopre un meccanismo di ottimizzazione nel sistema CRISPR-Cas13
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Il sistema di editing genico CRISPR-Cas è da tempo al centro della ricerca come strumento promettente per l'editing del genoma. Tuttavia, l'enfasi è stata posta sui suoi meccanismi di base e sulle nucleasi. Al contrario, poche ricerche hanno esaminato come i sistemi CRISPR-Cas si sono evoluti e sono stati ottimizzati. In collaborazione con le università di Lipsia, Friburgo e Michigan (USA), un gruppo di ricerca dell'Istituto Helmholtz per la ricerca sulle infezioni basate sull'RNA (HIRI) di Würzburg ha scoperto un meccanismo di ottimizzazione in CRISPR-Cas13, fornendo indicazioni sull'evoluzione di questi sistemi. I risultati sono stati recentemente pubblicati sull'EMBO Journal.
I sistemi CRISPR-Cas sono gli unici sistemi immunitari acquisiti conosciuti nei batteri. Sono in grado di immagazzinare informazioni genetiche dai fagi-virus che infettano i batteri per combattere infezioni future. Negli array CRISPR, che sono sequenze di DNA, un frammento di DNA del fago attaccante è archiviato tra due ripetizioni di sequenza fissa. Ogni frammento virale produce un acido ribonucleico CRISPR (crRNA), che istruisce il sistema a riconoscere lo stesso intruso in caso di nuovo attacco.
Il meccanismo sottostante è complesso e consiste in diversi componenti che lavorano insieme simultaneamente. Tuttavia, questi componenti possono interferire l'uno con l'altro. Ad esempio, per memorizzare una matrice CRISPR, questa deve iniziare e terminare con una ripetizione. Ciò comporta una ripetizione di troppo a un'estremità, che produce un RNA CRISPR - tutto privo di "frammenti virali". "L'RNA CRISPR risultante, noto come RNA CRISPR estraneo (ecrRNA), nel migliore dei casi è uno spreco. Nel peggiore dei casi, distrae il macchinario CRISPR e gli impedisce di cercare i virus infettanti", spiega Chase Beisel, capo dipartimento affiliato all'HIRI e membro di facoltà dell'Istituto Botnar di ingegneria immunitaria di Basilea, in Svizzera. Beisel ha avviato la ricerca, che è stata recentemente pubblicata sull'EMBO Journal.
Ma la natura ha una soluzione: In uno studio del 2022 pubblicato su Nature Microbiology, Beisel e il suo team hanno dimostrato che un tipo di sistemi CRISPR-Cas, che utilizzano la nucleasi Cas9 per tagliare il DNA, può impedire la formazione di ecrRNA introducendo un RNA aggiuntivo a monte della ripetizione problematica. "L'RNA si lega alla prima ripetizione e fa in modo che non venga riconosciuta dal macchinario CRISPR", spiega Beisel.
Per molto tempo, tuttavia, non era chiaro se anche altri sistemi CRISPR-Cas utilizzassero questa soluzione. Insieme a scienziati delle università di Lipsia, Friburgo e Michigan negli Stati Uniti, i ricercatori dell'Istituto Helmholtz per la ricerca sulle infezioni basate sull'RNA (HIRI), un sito del Centro Helmholtz di Braunschweig per la ricerca sulle infezioni (HZI) in collaborazione con la Julius-Maximilians-Universität di Würzburg (JMU), hanno studiato se i sistemi CRISPR-Cas13 - che hanno poca somiglianza con i sistemi CRISPR-Cas9 - producono ecrRNA e, in caso affermativo, come li contrastano.
Una soluzione intersistemica
"Abbiamo scoperto che molti sistemi CRISPR-Cas13 utilizzano anche un RNA per prevenire la formazione di ecrRNA", spiega Angela Migur, ex ricercatrice post-dottorato nel laboratorio di Chase Beisel. Con la prima ripetizione, questo RNA protettivo forma una struttura stabile simile a una forcina. Ciò impedisce alla nucleasi Cas13 di legarsi alla ripetizione, elaborarla e quindi produrre un ecrRNA. "La comparsa della 'forcina' era inaspettata, poiché i sistemi CRISPR-Cas9 e CRISPR-Cas13 si sono evoluti in modo indipendente e funzionano in modo molto diverso", aggiunge Migur. "Sorprendentemente, però, i meccanismi che inibiscono la formazione di ecrRNA sono molto simili".
Queste osservazioni indicano un caso notevole di evoluzione convergente: diversi sistemi CRISPR-Cas hanno sviluppato in modo indipendente meccanismi per superare ostacoli comuni nella difesa immunitaria.
Il team ha anche scoperto che non tutti i sistemi CRISPR-Cas si affidano a questo RNA protettivo. Il fattore decisivo è stato se la ripetizione aggiuntiva si è verificata all'inizio o alla fine dell'array CRISPR. Questa osservazione suggerisce che ci sono ancora altre strategie distinte da scoprire per migliorare l'efficacia dei sistemi CRISPR-Cas.
Nuove prospettive di ricerca
Le nucleasi Cas13 sono oggi ampiamente utilizzate come strumenti di ricerca e come metodo non permanente per l'editing genico a livello di RNA. La scoperta del team di ricerca potrebbe contribuire a rendere questi sistemi più efficaci, garantendo che vengano prodotti solo gli RNA CRISPR previsti. Inoltre, esiste la possibilità di inibire la difesa virale da parte del sistema CRISPR-Cas utilizzando gli ecrRNA, rendendo lo strumento genetico più facile da controllare.
Sebbene la ricerca abbia già compiuto enormi sforzi per caratterizzare i nuovi sistemi CRISPR-Cas, si è concentrata principalmente sui meccanismi fondamentali dell'immunità adattativa, in particolare sulle proprietà delle rispettive nucleasi. Tuttavia, finora sono state condotte poche ricerche su come i singoli componenti di questi sistemi siano coordinati in modo ottimale per garantire che la loro interazione sia il più efficiente possibile. In questo studio è stato scoperto un inconveniente della struttura delle matrici CRISPR, a cui si può facilmente porre rimedio con una semplice forcina di RNA. "Ci auguriamo che il nostro lavoro incoraggi la comunità di ricerca a indagare più intensamente sui limiti dei sistemi CRISPR-Cas e di altri meccanismi di difesa batterici. Allo stesso tempo, è importante chiarire quali strategie questi sistemi hanno sviluppato per superare tali ostacoli nel modo più efficace possibile", ha dichiarato Beisel.
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