Descobrir interruptores de genes ocultos
"A técnica pode ser utilizada para estudar as partes vastas e desconhecidas do nosso ADN que influenciam a saúde e a doença em vários sistemas de órgãos"
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Os investigadores liderados por Dubravka Vučićević no Centro Max Delbrück desenvolveram um novo método para descobrir como o ADN controla os genes. A sua técnica, publicada na revista "Cell Genomics", pode revelar os "interruptores" genéticos que regulam genes importantes mais rapidamente do que os métodos existentes.
A maior parte do genoma humano não codifica proteínas. Em vez disso, grande parte é constituída por regiões reguladoras. Tal como os interruptores que acendem e apagam as luzes, estas regiões de nucleótidos - chamadas potenciadores de transcrição - determinam onde e quando um gene está ativo e controlam em grande medida a quantidade da proteína correspondente que uma célula produz. Os defeitos no código genético destes elementos reguladores podem causar defeitos de desenvolvimento e doenças. Mas, em comparação com as regiões codificadoras de proteínas, são difíceis de identificar porque estão frequentemente localizados longe dos genes que regulam e não têm um código genético bem definido.
Os cientistas do Centro Max Delbrück, liderados pela Dra. Dubravka Vučićević no laboratório de Genómica Computacional e Reguladora do Professor Uwe Ohler, criaram uma nova e poderosa ferramenta para descobrir estas regiões que controlam os nossos genes. Chamado TargEted SingLe-cell Activation screen
(TESLA-seq), combina a ativação de genes com base em CRISPR (CRISPRa) - uma técnica de regulação de genes que utiliza uma forma modificada do sistema CRISPR-Cas9 para aumentar a expressão de genes específicos - e a sequenciação de ARN de uma única célula para identificar regiões reguladoras com maior rapidez e precisão do que outros métodos. O estudo foi publicado na revista "Cell Genomics".
"Com este método, podemos realmente testar como milhares de elementos reguladores candidatos no genoma são capazes de ligar genes - e descobrir exatamente quais genes eles influenciam", diz Vučićević, principal autor do estudo.
Mapeamento de elementos reguladores
Para demonstrar a técnica, o estudo concentrou-se num gene chamado PHOX2B, que é essencial para o desenvolvimento do sistema nervoso. As mutações no gene têm sido associadas ao neuroblastoma, um cancro do tecido do sistema nervoso que afecta principalmente as crianças.
Vučićević e os seus colegas concentraram-se numa grande área em torno do PHOX2B. Conceberam dois a três RNAs-guia (gRNAs) para se ligarem a secções do ADN, ou pedaços, cada um com 100 pares de bases de comprimento. Estes gRNAs guiaram o sistema CRISPR para locais-alvo no genoma. Com um total de 46.722 gRNAs, conseguiram analisar toda a paisagem genómica em torno do gene PHOX2B em busca de potenciais interruptores de genes.
Em seguida, transferiram cada gRNA para uma única célula de neuroblastoma humano. O sistema CRISPRa activou então quaisquer regiões reguladoras que pudessem estar presentes no "pedaço". Identificaram mais de 600 regiões - chamadas CaREs (elementos responsivos à CRISPRa) - que alteravam o crescimento celular quando activadas.
A equipa analisou mais detalhadamente cerca de 200 CaREs e utilizou a sequenciação de ARN de uma única célula para ler tanto o ARNg no interior de cada célula como o ARN expresso a partir de genes próximos. Isto permitiu-lhes ligar cada CaRE a qualquer um dos mais de 70 genes da região PHOX2B, cuja expressão se alterou nessa célula. Encontraram também ligações diretas entre CaREs e reguladores importantes de SHISA3 e APBB2, que estão envolvidos no cancro e na doença de Alzheimer.
Surpreendentemente, muitos CaREs controlavam genes distantes, ignorando totalmente os genes próximos - algo que outros métodos muitas vezes não detectam. "O TESLA-seq não capta apenas o que está a acontecer num tipo de célula, mas pode revelar potenciais ligações entre genes e regiões reguladoras em diferentes sistemas biológicos", afirma Ohler.
Isto é significativo porque muitas doenças afectam mais do que um único tipo de tecido, acrescenta Vučićević. "A técnica pode ser utilizada para estudar as partes vastas e desconhecidas do nosso ADN que influenciam a saúde e a doença em vários sistemas de órgãos e pode ajudar-nos a conceber terapias mais precisas e eficazes."
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