In-situ-Hybridisierung

Die In-situ-Hybridisierung (ISH, auch Hybridisierung in situ) ist ein Verfahren, um Nukleinsäuren, also RNA oder DNA, in Geweben, einzelnen Zellen oder auf Metaphase-Chromosomen nachzuweisen. Dabei wird eine künstlich hergestellte Sonde aus einer Nukleinsäure eingesetzt, die über Basenpaarungen an die nachzuweisende Nukleinsäure "hybridisiert", also bindet. Die Bezeichnung „in situ“ wird verwendet, da der Nachweis direkt in der jeweiligen Struktur durchgeführt wird, und nicht etwa biochemisch im Reagenzglas.

Weite Verbreitung haben die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) für den Nachweis von DNA oder RNA (RNA-FISH) in einzelnen Zellen oder auf Metaphase-Chromosomen sowie die Untersuchung der Verteilung von mRNA in ganzen Embryonen, Schnitten oder Geweben mit farbgebenden (chromogenen) Enzymen.

Weitere verwendete Bezeichnungen sind Genomische in situ Hybridisierung (GISH), bei der als Sonde gesamt-genomische DNA eingesetzt wird, sowie chromosomale in situ Suppressions (CISS)-Hybridisierung, mit der die Markierung von ganzen Chromosomen möglich ist.

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Geschichte

In situ Hybridisierung wurde Ende der 1960er Jahre von den US-amerikanischen Biologen Mary Lou Pardue und Joe Gall entwickelt ^{[1], [2]}. Sie verwendeten radioaktiv markierte Sonden, die Präparate mussten anschließend auf einen Röntgenfilm gelegt werden. Neben den allgemeinen mit Radioaktivität verbundenen Problemen war die räumliche Auflösung dabei verglichen mit heutigen Techniken schlecht. Daher setzten sich später Sonden durch, an die kovalent Markierungsmoleküle gebunden waren (siehe unten).

Funktionsweise

Die in-situ-Hybridisierung beruht auf der Paarung von komplementären Basen auf zwei Nukleinsäure-Einzelsträngen. Einer der beiden Stränge kommt dabei von einer zuvor hergestellten und markierten Sonde, der andere liegt im Präparat vor und soll nachgewiesen werden. Die ersten Arbeitsschritte sind demnach Vorbereitung des Präparats sowie Vorbereitung der Sonde. Die Sonde besteht meist aus DNA, da diese stabiler ist als RNA und somit im Labor einfacher zu handhaben ist. Auch lässt sich DNA mit heutigen Verfahren einfacher vermehren. Die Markierung der Sonde kann indirekt mit Haptenen (z.B. Digoxigenin, Biotin oder Dinitrophenol) oder bei der FISH auch direkt mit fluoreszierenden Molekülen wie FITC oder Cy3 erfolgen. Häufig eingesetzte Verfahren zur Markierung der Sonden sind Nick-Translation und PCR.

Da DNA normalerweise als Doppelstrang vorliegt muss dieser zuvor getrennt (auch: aufgeschmolzen oder denaturiert) werden. Eine Denaturierung kann entweder durch Verschiebung des pH-Werts (sowohl sauer als auch alkalisch) oder durch Hitze erfolgen. Bei einer Hitzedenaturierung wird der Schmelzpunkt meist durch Zugabe von Formamid abgesenkt, welches durch seine starke Polarität die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den DNA-Einzelsträngen abschwächt.

Die eigentliche Hybridisierung dauert, je nach dem was nachgewiesen werden soll, zwischen einer Stunde und mehreren Tagen. Anschließend liegen im Präparat Hybridmoleküle aus den Nukleinsäuren des Präparats und der Sonde vor. Nicht gebundene Sondenmoleküle werden herausgewaschen und gebundene Sondenmoleküle können nachgewiesen werden. Bei der indirekten Markierung geschieht dies über eine Antikörperfärbung oder im Fall von Biotin mit Avidin. Die Antikörper (oder das Avidin) sind wiederum an Fluorochome (bei der FISH) oder an Enzyme gebunden, welche aus zuzugebenden Substraten Farbmoleküle erzeugen. Beides wird anschließend mikroskopisch ausgewertet.

Nachweis von mRNA mit farbgebenden Enzymen

Bei dieser Anwendung findet vor allem Digoxigenin-markierte RNA Verwendung. Das Digoxigenin kann mit Hilfe eines Antikörpers, der beispielsweise mit einem Enzym gekoppelt ist, erkannt werden. Das Enzym, meistens Alkalische Phosphatase oder Peroxidase, kann dann durch Zusatz von Reagenzien einen Farbstoff umsetzen, der kovalent im Gewebe gebunden bleibt und sich daher nicht durch Diffusion verteilt. Beim Nachweis von mRNA in Geweben werden nur jene Zellen angefärbt (hybridisiert), in denen ein zu untersuchende Gen aktiv ist: Nur hier liegt die entsprechende mRNA vor. Dieses Verfahren findet besonders in der Entwicklungsbiologie Anwendung. Hier ist es von besonderem Interesse, die Aktivität eines Gens beispielsweise während der Embryogenese in situ zu verfolgen. Das embryonale oder auch adulte Gewebe muss für die Färbung zunächst fixiert werden; die Aktivität kann daher nicht in Echtzeit verfolgt werden, sondern ist nur eine Momentaufnahme des Zustands, in dem sich das Gewebe befand, als es fixiert wurde.

Ablauf

Das zu färbende Gewebe - beispielsweise Embryonen von verschiedenen Modellorganismen wie Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Xenopus laevis, Mus musculus, Danio rerio - wird mit Hilfe von formaldehydhaltigen Lösungen fixiert. Anschließend wird es in einen formamidhaltigen Puffer überführt und die markierte Sonde dazugegeben. Die Hybridisierungszeit hängt von der Größe des Embryos ab und dauert mindestens einige Stunden. In dieser Zeit kann die Sonde durch das Gewebe diffundieren und bindet überall dort, wo sich komplementäre Sequenzen in der mRNA finden. Es folgen einige Waschschritte, in denen überschüssige, nicht gebundene Sonden ausgewaschen werden, und am Schluss die Färbung, die dann mit einem Mikroskop genau analysiert und dokumentiert werden kann.

Neben Totalpräparaten, beispielsweise von Fliegenembryonen (linke Abbildung), kann die In-situ-Hybridisierung an Gewebe-Dünnschnitten durchgeführt werden. Auf diese Weise können auch größere Präparate wie menschliches Gewebe oder komplette Mausembryonen untersucht werden (rechte Abbildung).

Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung

Bei der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) wird die Sonde mit Hilfe eines fluoreszierenden Farbstoffes nachgewiesen. Dies ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Strukturen durch den Einsatz verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe, zum Beispiel den Nachweis, dass zwei verschiedene Gene in ein und derselben Zelle exprimiert werden, was mit Hilfe konventioneller Färbemethoden nur eingeschränkt möglich ist. Auf Chromosomenpräparaten und auf Zellkernen konnten bereits bis zu sieben verschiedene Farbstoffe erfolgreich eingesetzt werden ^[3]

In der Diagnostik wird FISH auch als (FisH-Test) bezeichnet. Dieser kann beispielsweise im Zuge der Pränataldiagnostik an Zellen des ungeborenen Kindes durchgeführt. Durch die Betrachtung der gefärbten Chromosomen über ein Fluoreszenzmikroskop können dabei numerische Chromosomenaberrationen wie z.B. Down-Syndrom, aber auch strukturelle Chromosomenbesonderheiten wie das Katzenschrei-Syndrom schnell und einfach nachgewiesen werden. Dieses Verfahren wird derzeit nicht von den staatlichen Krankenkassen bezahlt, da eine konventionelle Chromosomenanalyse über die Betrachtung eines Karyogramms in der Regel den selben Zweck erfüllt. Die Zeit, bis die Ergebnisse vorliegen, ist bei FisH kürzer als bei der konventionellen Methode.

Literatur

• Leitch AR, Schwarzacher T, Jackson D, Leitch IJ (1994): In situ-Hybridisierung, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlin

Quellenangaben

1. ↑ Joseph G. Gall and Mary Lou Pardue. FORMATION AND DETECTION OF RNA-DNA HYBRID MOLECULES IN CYTOLOGICAL PREPARATIONS. Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 June; 63(2): 378–383. kostenloser Web-Zugriff
2. ↑ Mary Lou Pardue and Joseph G. Gall. MOLECULAR HYBRIDIZATION OF RADIOACTIVE DNA TO THE DNA OF CYTOLOGICAL PREPARATIONS. Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 October; 64(2): 600–604. kostenloser Web-Zugriff
3. ↑ Andreas Bolzer, Gregor Kreth, Irina Solovei, Daniela Köhler, Kaan Saracoglu, Christine Fauth, Stefan Müller, Roland Eils, Christoph Cremer, Michael R. Speicher, Thomas Cremer: Three-dimensional maps of all chromosome positions demonstrate a probabilistic order in human male fibroblast nuclei and prometaphase rosettes. In: PLoS Biology. 3, Nr. 5, April 2005, S. e157. PMID 15839726. doi:10.1371/journal.pbio.0030157