Transfektion

Unter Transfektion versteht man das Einbringen von Fremd-DNA in eukaryotische Zellkulturzellen.^[1] Dabei unterscheidet man zwischen dem nur zeitweiligen Einbringen des Plasmids in die Wirtszelle (transiente Transfektion) und dem dauerhaften Einbau in das Genom (stabile Transfektion). Durch Abbauprozesse wird fremde DNA normalerweise schnell abgebaut, nach dem Einbau in die Wirts-DNA wird dieser Vorgang jedoch unterbunden.

Je nach Zellart eignen sich verschiedene Verfahren.

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Chemische Verfahren

Im Prinzip handelt es sich hierbei um einen Spezialfall der Transformation, die jedoch als Methode eher in der Mikrobiologie Verwendung findet.

Calcium-Phosphat-Präzipitation

Das am häufigsten verwendete Transfektionsverfahren ist die Calcium-Phosphat-Präzipitation. In einem Gemisch aus Calciumchlorid und Natriumphosphat bindet sich die zu übertragende DNA an ausfallendes Calciumphosphat. Die ausgefallenen Kristalle werden der Zellkultur zugegeben und von den Zellen durch Endocytose aufgenommen. Die "Berieselung" der Zellen mit dem Präzipitat ist für die Zellen negativer Stress. Der ganze Vorgang ist stark von einer Vielzahl von Parametern abhängig, deren richtige Einstellung zudem von Zellart zu Zellart variiert:

• Menge der Plasmid-DNA
• Reinheit der Plasmid-DNA
• Konzentration der Carrier-DNA (ein Überschuss an genomischer DNA zur Bildung einer ausreichenden Menge an Präzipitat)
• Quelle der Carrier-DNA (optimal ist autologe DNA)
• Größe der Carrier-DNA
• Salzkonzentration und pH der Lösung
• Inkubationsdauer
• Präselektionsdauer bei Herstellung von Zellinien durch permanente Expression bzw. Erholungsphase bei der Messung der rekombinanten Genaktivität bei transienter Expression

Die Methode erfordert experimentelles Geschick und ist nicht für alle Zellen mit gleichem Erfolg anwendbar. Sie funktioniert nur bei adhärent wachsenden Zellen wie z. B. den etablierten Nagerzellinien der L-Zellen und 3T3-Zellen von Mäusen sowie den Hamsterzelllinien BHK und CHO zufriedenstellend.

Lipofektion

Genetisches Material wird mit Hilfe von Liposomen, Vesikeln, die sehr leicht mit der Zellmembran fusionieren in die Zelle eingebracht. Hierbei gibt es zwei prinzipiell unterschiedliche Ansätze:

• Einschluss der DNA in das Lumen unilamellarer Phospholipidvesikel
• Komplexierung der DNA an der Oberfläche kationischer Lipidvesikel

Historisch ist das Einschlussverfahren das ältere Verfahren. Auch hier gibt es wieder eine Vielzahl möglicher Techniken, von denen hier nur zwei vorgestellt werden:

• Erythrocyten Ghosts. Erythrocyten werden in einer hypotonischen Lösung lysiert. Nach Austritt des Zellinhaltes kommt es zu einer spontanen Wiederversiegelung der verbleibenden Hüllen - engl. ghosts - unter Einschluss des umgebenden (DNA-haltigen) Mediums. Die Hüllen werden dann mit Verfahren der Zellfusion mit den Zielzellen verschmolzen. Die eingeschlossenen Volumina sind im Vergleich zu allen anderen Methoden riesig. Jedoch ist die Methode experimentell sehr knifflig.
• Die Ätherinfusionsmethode. Eine ätherische Lösung von Phospholipiden wird langsam über eine Injektionsnadel in 37°C warme Salzlösung eingespritzt. Mit dem Verdampfen des Äthers bilden sich spontan große unilamellare Phopholipidvesikel, die bei optimaler Ausführung der Technik bis zu 30% der wässrigen Phase einschließen können. Die Vesikel können spontan mit den Zielzellen verschmelzen.

• Kationische Lipidvesikel Im Unterschied zu den beiden anderen Methoden ist dies ist kein Einschlussverfahren. Dieses auf kationischen Lipiden beruhende Verfahren ist technisch einfacher in der Durchführung. Als erste Verbindung wurde DOTMA (N-[1-(2, 3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride) eingesetzt. Aus Mischungen von DOTMA mit Phoshpolipiden werden positiv geladene Lipsomen hergestellt, an die die negativ geladene Plasmid-DNA bindet. Es entstehen dabei größere Komplexe, die von den Zielzellen aufgenommen werden. Mittlerweile gibt es eine Vielzahl verschiedener kationischer Lipide, die für diesen Zweck eingesetzt werden. Aber diese Behandlung stellt einen sogar stark schädigenden Stress für die Zellen dar und muss sorgfältig optimiert werden u. a. Verhältnis Lipid/DNA, Konzentration der Komplexe, Inkubationsdauer.

Kationische Polymere

Das älteste derartige Verfahren ist die Komplexierung von Plasmid-DNA mit Diethylaminoethyl-Dextran. Die DEAE-Dextran Methode ist recht zellverträglich und erzielt hohe Transfektionseffizienzen von bis zu 30%, erlaubt aber nur transiente Transfektionen. Die neueren Verfahren benutzen kationische Dendrimere. Diese positiv geladenen, stark verzweigten Polymere komplexieren die Plasmid-DNA und werden von den Zielzellen aufgenommen. Die Methode ist in der Regel besser zellverträglich als die kationische Lipofektion.

Physikalische Verfahren

Mikroinjektion

Bei der Mikroinjektion wird die DNA als Plasmid, ssDNA (einzelsträngige DNA) oder dsDNA (doppelsträngige DNA) direkt in den Zellkern bzw. ins Cytoplasma der Zelle mit Hilfe einer Mikrokapillare injiziert. Das Verfahren ist sowohl apparativ sehr aufwändig als auch manipulativ höchst anspruchsvoll.Benötigt werden:

• Mikrokapillaren, in die einige Nanoliter DNA-Lösung aufgezogen werden
• ein Mikroinjektor, der mittels eines präzisen Luftstosse einige Femtoliter der Lösung aus der Spitze der Kapillare presst.
• Mikromanipulatoren, zur Justierung der Injektionskapillare
• ein hochwertiges Inversmikroskop, über das der Experimentator die visuelle Kontrolle behält

Das Verfahren besitzt eine Transfektionseffizienz von nahezu 100% und erlaubt im Gegensatz zu allen anderen Methoden die Transfektion mitotisch ruhender Zellen, da hier die Kernmembran auf direktem, mechanischem Wege überwunden wird. Allerdings können nur relativ wenige Zellen in einem vernünftigen Zeitraum transfiziert werden - je nach Übung 60-200 pro Stunde.

Geschichte: 1979 wurden die ersten menschlichen Zellen mit Glaskapillaren mikroinjiziert. 1976 konnte die Translation von mRNA's nachgewiesen werden. Dazu wurde Enten-mRNA in menschlichen Zellen und in Mauszellen translatiert. Es fanden normale Teilungen der mikroinjizierten Zellen statt. Außerdem konnte die Translation über mehrere Zellgenerationen bei injizierter Globin-mRNA nachgewiesen werden.

Verfahren: Die zu injizierenden Zellen werden auf einem Mikroinjektionsdeckglas mit 9.Feld-Raster gezüchtet. DNA- oder RNA-Lösung können anschließend über den Mikroinjektor per Druckluft in die Zellen injiziert werden. Danach müssen die Zellen für 24 Stunden im Brutschrank inkubiert werden. Während dieser Zeit findet die Translation der injizierten Sequenzen statt und es bilden sich neue Proteine. Mit dem Verfahren der Mikroinjektion ist es möglich, das Vorhandensein einer bestimmten mRNA mit unbekannten, dazugehörigen Gen zu bestimmen.

Elektroporation

Bei einer Elektroporation wird die Zellmembran durch Spannungspulse für DNA permeabel gemacht. Nennenswerte Transfektionsraten erhält man nur unter Bedingungen, die gleichzeitig je nach Zelltyp zwischen 20-50% aller Zellen abtöten. Da die Zellen nicht adhärent vorliegen müssen, bietet sich das Verfahren vor allem für Suspensionskulturen an.

Zum Mechanismus: Man kann sich die Zellmembran (Plasmamembran) als einen Plattenkondensator vorstellen, denn die Lipiddoppelschicht wirkt als Isolator. Da die Zellmembran eine Isolierung des elektrisch leitfähigen Cytoplasmas darstellt, kann elektrischer Strom so lange nicht durch die Zelle fließen, bis Poren in der Membran entstanden sind. Wird nun eine elektrische Spannung angelegt (Feldstärke mehrere kV/cm), so kommt es zur Polarisierung der Membran. Erreicht die transmembrane Spannung einen kritischen Wert von 0,4 bis 1 V, so kommt es durch eine lokale Zerstörung der Membranintegrität spontan zur drastischen Erhöhung ihrer Leitfähigkeit. Primär in der Membran entstandene hydrophoben Poren verwandeln sich bei Erreichen eines kritischen Radius spontan in relativ stabile hydrophile Poren (0,5-1 nm) mit einer Lebensdauer von wenigen Sekunden bis einigen Minuten, denn 1. bricht die Membranspannung wegen des Ladungsausgleiches durch die Poren wieder zusammen und 2. ist die Membran ein selbstorganisierendes System, dass sich selbst reorgansiert. ^[2][3]

Jüngere Forschungen an der Universität Lyon haben gezeigt, dass das Phänomen auch natürlicherweise vorkommt. So machen die elektrischen Entladungen bei Gewittern die Zellwände von im Boden lebenden Bakterien durchlässig, so dass fremde DNA aufgenommen werden kann. Diese Tatsache könnte eine wesentliche Rolle bei der beschleunigten Evolution von Mikroorganismen spielen.

Particle Gun

Auch dieses Verfahren ist apparativ sehr aufwändig. Die DNA wird an Mikroprojektile z. B. Wolframpartikel adsorbiert. Die Mikroprojektile werden auf einem Makroträger fixiert. Dieser wird extrem beschleunigt. Ursprünglich durch eine Schwarzpulverladung - daher der Name particle gun - in den aktuellen Geräten durch Gas. Das Gas wird mechanisch vorkomprimiert. Wenn ein kritischer Druck überschritten wird, bricht eine Scheibe, hinter der sich der Makroträger befinden. Dessen Beschleunigung wird durch ein grobmaschiges Aufprallsieb abrupt gebremst, so dass die Mikroprojektile sich ablösen und mit hoher Geschwindigkeit durch das Sieb auf die Zielzellen zuschiessen. Sie werden erst in den Zellen abgebremst, wobei es dann zur Ablösung der DNA kommt.

Interessante Einsatzmöglichkeiten der particle gun sind:

• aufgrund der großen mechanischen Kraft eignet sich die Methode vorzüglich zur Penetration von pflanzlichen Zellen, deren Zellwand bei allen anderen Verfahren eine unüberwindliche Barriere darstellt und erst entfernt werden müsste.
• in vivo Transfektion von Organen z. B. Transfektion einer Leber zur Gentherapie
• die einzige Methode zur Transfektion von Organellen wie Mitochondrien oder Chloroplasten

Biologische Verfahren

Darunter fallen alle Methoden, bei denen biologische Transportmechanismen dazu ausgenutzt werden, die Plasmid-DNA in die Zelle zu schleusen.

Transferinfektion

Dies war das erste Beispiel einer rezeptorvermittelten Transfektion. Proteinchemisch wurde ein Konjugat aus dem Eisentransportprotein Transferrin und kationischem Poly-Lysin hergestellt. Dieses Konjugat konnte in hohem Maße Plasmid-DNA binden und hatte die Fähigkeit beibehalten an den zellulären Transferrinrezeptor zu binden. Durch die zellulären Transportmechanismen landet das Konjugat in den Lysosomen. Dort muss wie auch bei den chemischen Verfahren die DNA freigesetzt werden, diese die lysosomale Membran überwinden und in den Zellkern gelangen. Die Methode erzielte beeindruckende Erfolge bei Zelllinien mit atypisch hoher Dichte an Transferrinrezeptoren, zeigte bei "normalen" Zellen aber keinen Vorteil gegenüber herkömmlichen Methoden.

Antikörper vermittelte Transfektion

Dies ist kein Standardverfahren für die Routinetransfektion und soll hier nur erwähnt werden, weil es interessante Aspekte für eine in vivo Anwendung im Rahmen von drug targeting bzw. Gentherapie aufwirft. Anstelle von Transferrin wird für das Konjugat ein Antikörper gegen ein für die Zielzelle spezifisches Membranprotein verwendet. Zur Bekämpfung von Tumoren könnte das DNA-Plasmid für ein Toxin kodieren.

Literatur

• Schmitz, Sabine: Der Experimentator: Zellkultur. Spektrum Akademischer Verlag; 1. Auflage 2007. ISBN 3827415640

Quellen

1. ↑ Lottspeich, F. und Engels, J.W.: Bioanalytik. Spektrum Akad. Verlag
2. ↑ Klenchin, V.A. und Sukharev, S.I. und Serov, S.M. und Chernomordik, S.V. und Chizmadzhev, Yu.A. (1991): Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis. In: Biophys J. Bd. 60, Nr. 4, S. 804–811. PMID 1660315
3. ↑ Sukharev, S.I. und Klenchin, V.A. und Serov, S.M. und Chernomordik, S.V. und Chizmadzhev, Yu.A. (1992): Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores. In: Biophys J. Bd. 63, Nr. 5, S. 1320–1327. PMID 1282374