Virologische Diagnostik

Zur Abklärung einer virologischen Erkrankung bestehen verschiedene Möglichkeiten der Virologischen Diagnostik. Im Frühstadium der Infektion werden zuerst Antigenteste (d.h. Nachweis von einzelnen Proteinen des Virus) oder Genomnachweise (d.h. Nachweis des Erbguts des Virus)durchgeführt. Im fortgeschrittenen Krankheitsstadium können dann auch Antikörpernachweise (d.h. Der Nachweis von spezifischen Antikörpern des Infizierten gegen das Virus) durchgeführt werden. Dabei ist in der frühen Phase der Nachweis von Antikörpern der Immunglobulin-Klasse M (IgM) und später der Nachweis von Antikörpern der Immunglobulin-Klasse G (IgG) angebracht. Bei einigen viralen Infektionen kann auch der Nachweis der Antikörper der Immunglobulin-Klasse A (IgA) angebracht sein. Bei einer Vielzahl virologischer Erreger erfolgt die Abfolge dieser Untersuchung nach einem mehr oder weniger vorgegebenen Muster, das als Stufendiagnostik bezeichnet wird. Am Beispiel einer Hepatitis C (HCV) Infektion soll die Stufendiagnostik erläutert werden.

• Der behandelnde Arzt stellt den Verdacht einer HCV-Infektion
• Im ersten Schritt wird das Blut des Patienten auf Antikörper gegen das HCV untersucht.
  • Falls keine Antikörper nachgewiesen werden können, kann angenommen werden, dass der Patient keine HCV-Infektion durchgemacht hat. Allerdings muss berücksichtigt werden, dass der Patient sich in der Frühphase einer Infektion befindet und noch keine Antikörper gegen das Virus gebildet wurden.
  • Bei jedem Nachweis von Antikörpern gegen das Virus wird das Ergebnis in einem anderem Test (Bestätigungstest) validiert. Werden auch in diesem Test Antikörper gegen das Virus nachgewiesen, so kann davon ausgegangen werden, dass der Patient eine HCV-Infektion hat oder hatte.
• Zur weiteren Abklärung der Infektion werden eine PCR (als direkter Erregernachweis und zur Bestimmung der Viruslast und damit verbunden der Infektiosität des Patienten) und eine Typisierung des Virus (Bestimmung des Subtyps des Virus) durchgeführt. Diese beiden Teste liefern wichtige Informationen für die Planung und Überwachung eines Therapieversuchs.

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Verfahren zum Antigen- (Ag), Genom- oder Erregernachweis

• Virusisolierung

Die Virusisolierung ist immer dann angebracht, wenn im Patientenmaterial sehr wenig virales Antigen nachweisbar ist. Zu diesem Zweck wird das Patientenmaterial auf Zellkulturen gegeben. Die im Material enthaltenen Viren infizieren dann diese Zellen und vermehren sich. Falls eine Infektion erfolgt, kann bei einigen Viren eine Veränderungen der Morphologie der Zellen (cytopathischer Effekt, CPE) beobachtet werden. Allerdings verursachen nur einige Viren einen cytopathischen Effekt (z.B. Herpes Simplex Viren, Windpockenviren, Influenzaviren, Humane Adenoviren, Picornaviren, Enteroviren, Masernviren, Mumpsviren und Rötelnviren). Einige andere Viren verursachen keinen CPE oder es existieren keine Zellen, die in vitro von diesen Viren infiziert werden. Die Zellen, die einen CPE zeigen oder der Kulturmedienüberstand dieser Zellen können dann für weitere diagnostische Untersuchungen verwendet werden (siehe IFT, Ag-Nachweis in Zellen, Elektronenmikroskopie).

• Elektronenmikroskopie

Viren die in hoher Quantität im Patientenmaterial vorhanden sind können nach Fixierung und Kontrastierung im Elektronenmikroskop betrachtet werden. Die Identifizierung kann nur von Personen mit langer Berufserfahrung durchgeführt werden. Sie ist sehr schnell, allerdings ist die Erstanschaffung eines Elektronenmikroskops mit 200.000 bis 500.0000 € sehr teuer.

• Ag-ELISA

Bei Infektionen mit Adenoviren oder Rotaviren kann der Stuhl des Patienten als Ausgangsmaterial für einen Ag-ELISA dienen (ELISA: Enzyme-linked Immunosorbent Assay). Diese Viren werden in großer Zahl im Stuhl ausgeschieden. Die viralen Proteine werden bei diesem Verfahren von markierten virus-spezifischen Antikörpern (AK) gebunden. Über die Markierung (z.B fluoreszierende Farbstoffe, Enzyme) kann das Antigen dann indirekt charakterisiert werden. Auch bei Viren, die eine respiratorische Symptomatik hervorrufen können solche Tests aus Abstrichmaterialien oder vergleichbaren Materialien durchgeführt werden. Als Ausgangsmaterial für diese Test können auch angereicherte Proben (siehe Virusisolierung) dienen

• In situ-Hybridisierung

Die In situ-Hybridisierung ist ein Verfahren, dass vor allem bei der Identifizierung und Typisierung von Humane-Papilloma-Viren (HPV) angewendet wird.

• Polymerase-Kettenreaktion

Die Polymerase-Kettenreaktion (englisch Polymerase Chain Reaction, PCR) wird für den Nachweis von Genomäquivalenten der Erreger herangezogen. Für Viren, die ein RNA-Genom besitzen ist vor dem Nachweis mittels PCR noch ein Schritt notwendig, der die RNA in DNA umschreibt. Das Enzym, dass diesen Prozess katalysiert ist die Reverse Transkriptase (RT). Das umschreiben der RNA in DNA und die anschließende Amplifikation des Genoms via PCR wird unter der Abkürzung RT-PCR zusammengefasst. Die PCR bzw. RT-PCR ist für fast alle humanpathogenen Viren etabliert. Eingesetzt wird sie wenn andere Nachweisverfahren kein positives Ergebnis liefern, aber dringender Verdacht auf eine virale Infektion besteht (siehe oben), zur Bestimmung von Genomäquivalenten für prognostische Zwecke, zum Therapie-Monitoring oder falls keine anderen Methoden zur Verfügung stehen.

Verfahren zum Antikörpernachweis

Der Nachweis von Antikörpern, die gegen virale Erreger gerichtet sind liefert nur bedingt einen Hinweis auf eine akute Infektion. Der Nachweis der Antikörper der Klasse G (IgG) ist ein Hinweis auf eine zurückliegende Infektion oder auf eine Impfung. Der Nachweis vom IgM-Antikörpern kann ein Hinweis auf eine akute Infektion sein, jedoch sind AK der Klasse M bei vielen Viren auch noch nach der akute Phase nachweisbar. Um eine Aussage über das Stadium der Infektion machen zu können müssen 2 Proben im Abstand einiger Tage untersucht werden. Ein Anstieg der Antikörperkonzentration bzw. ein Titeranstieg kann als Hinweis auf eine frische oder wiederkehrende Infektion angesehen werden. Verfahren zum Antigen- (Ag), Genom- oder Erregernachweis sollten in vielen Fällen zur Abklärung ebenfalls herangezogen werden.

• Hämagglutinations-Hemmtest (HHT)

Der HHT findet nur Anwendung bei Viren, dessen Oberflächenproteine in der Lage sind Erythrozyten zu binden. Dieses Phänomen beruht auf der Bindung der viralen Proteine an Zuckerstrukturen auf der Oberflächen von Erythrozyten. Diese so gebundenen Erythrozyten bilden ein Netzwerk aus, das nicht mehr auf den Boden des Reaktionsgefäßes absinkt. Im HHT wird nun dem System aus Öberflächenproteinen des Virus und Erythrozyten das zu testende humane Serum zugegeben. Antikörper, die gegen das Virus gerichtet sind binden an die Öberflächenproteine der Viren und die Hämagglutination wird unterbunden. Zur Quantifizierung wird das zu testende Serum in Verdünnungsstufen in den Test eingebracht. Dadurch kann der Titer ermittelt werden, der gerade noch ausreicht, um die Hämagglutination zu unterbinden. In der Routinediagnostik wird dieser Test zur Bestimmung des Röteln-Titers verwendet.

• Neutralisationstest (NT)

Mit Hilfe von Neutralisationstesten werden Antikörper aus Patientenseren bestimmt, die tatsächlich eine schützende (protektive) Wirkung haben. Sie sind in der Lage die Infektion der Zellen durch das Virus zu neutralisieren. Angemerkt sei, dass gerade bei Viren die zelluläre Immunantwort eine entscheidende Rolle spielt, da falls die Viren in die Zelle eingedrungen sind, die humorale Immunantwort nur noch eingeschränkt eine Bedeutung bei der Neutralisation der viralen Infektion hat. Anwendung finden Neutralisationsteste bei Picornaviren und dem Cytomegalievirus.

• Komplementbindungsreaktion (KBR)

Die KBR erkennt im Wesentlichen nur IgG1, IgG3 und IgM Antikörper. Für die Diagnostik einer akuten Infektion sind daher 2 aufeinander folgende Serumproben (Abstand 5-10 Tage) notwendig, bei denen eine erhöhter KBR-Titer im Falle einer akuten Infektion festzustellen ist. Die KBR ist eine sehr alte Methode, die derzeit von neueren Verfahren s.u. abgelöst wird. Sie kann bei fast allen viralen Infektionen angewendet werden. In der Hauptsache findet sie aber Anwendung bei der virologischen AK-Diagnostik von Influenza A/B, Parainfluenza, RSV, VZV, Masern, Mumps und Adenoviren.

• Immunfluoreszenztest (IFT)

Ausgangsmaterial für den IFT sind meistens virus-infizierte Zellen. Diese wurden auf Glasplättchen fixiert und können mit dem Patientenserum inkubiert werden. Durch Waschung werden die nicht gebundenen AK abgewaschen und die Zellen werden mit einem zweiten AK inkubiert. Dieser AK ist mit einem Fluorochrom markiert. Dieser Farbstoff emittiert Licht einer bestimmten Wellenlänge, wenn er mit UV-Licht einer anderen Wellenlänge gestrahlt wird. Das Ergebnis kann im Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden. Sowohl IgG-Antikörper als auch IgM Antikörper können nachgewiesen werden. Angewandt wird die IFT für Patienten-Antikörper gegen viele Viren. Am häufigsten ist die Anwendung des IFT bei Infektionen mit Influenzaviren und dem Epstein-Barr-Virus.

• ELISA

Der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ist der Test, der für fast alle viralen Erreger angewendet wird. Durch den Einsatz von Teil- oder Vollautomaten, die die Teste bearbeiten, ist der ELISA aus wirtschaftlicher Sicht am weitesten verbreitet. Ansonsten gelten die in der Einführung erwähnten Einschränkungen.

• Western Blot

Der Western Blot wird hauptsächlich bei der Diagnostik von HIV 1 und 2, Röteln, CMV, EBV, Hanta-Viren, HTLV und HCV eingesetzt. Er wird verwendet, um die in dem ELISA-Test erhaltenen Ergebnisse zu bestätigen oder um weitere diagnostische Fragestellungen zu bearbeiten. Er bietet die Möglichkeit Antikörper gegen mehrere virale Proteine gleichzeitig nachzuweisen.

Quellen

• O.A. Haller und Th. Mertens Diagnostik und Therapie von Viruskrankheiten, Leitlinien der Gesellschaft für Virologie. Urban & Fischer ISBN 3-437-21970-7
• D. Falke (Hrsg.) Virologie am Krankenbett, Klinik, Diagnostik, Therapie. Springer ISBN 3-540-64261-7