Multiphotonenmikroskop

Die Multiphotonenmikroskopie (engl. Multi-Photon Laser Scanning Microscopy - MPLSM) ist ein lichtmikroskopisches Verfahren. Die Arbeitsweise eines Multiphotonenmikroskops ist der eines konfokalen Mikroskops vergleichbar.

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Prinzip

  Ein Laser rastert die zu untersuchende Probe Punkt für Punkt ab und regt geeignete Zielmoleküle zur Fluoreszenz an. Im Gegensatz zur üblichen Fluoreszenzmikroskopie wird jedoch nicht mit einer Wellenlänge angeregt, die unterhalb der emittierten Wellenlänge liegt (siehe Stokes-Shift), sondern mit deutlich größerer Wellenlänge. Im Fall der Zwei-Photonen-Mikroskopie beträgt bspw. die Anregungswellenlänge in etwa das Doppelte der zu beobachtenden Emissionswellenlänge, bei Drei-Photonen-Anregung ein Dreifaches etc.

Treffen mehrere Photonen gleichzeitig an einem Ort auf, so kann sich ihre Anregungsenergie addieren. Ein entsprechendes Zielmolekül (Fluorochrom) kann durch diese Energiesumme zur Abgabe eines Fluoreszenz-Photons angeregt werden. Die Wahrscheinlichkeit für gleichzeitiges Auftreffen der Photonen ist jedoch nur in einem eng begrenzten Volumen um die fokale Ebene herum ausreichend für eine messbare Fluoreszenz. Ähnlich der konfokalen Mikroskopie kann auf diese Weise eine einzelne Ebene der Probe scharf abgebildet werden. Durch Verschieben dieser Fokusebene ist eine dreidimensionale Bildgebung (Tomografie) möglich.

Als Anregungswellenlänge wird üblicherweise Licht aus dem nahen Infrarot-Spektrum (NIR) verwendet. Solches Licht zeigt eine größere Eindringtiefe in biologische Proben und verursacht weniger Photoschäden.

Geschichte

Das physikalische Prinzip der Anregung eines Moleküls durch mehrere Photonen geht zurück auf Maria Goeppert-Mayer. Das Verfahren selbst wurde in den 1990er Jahren entwickelt.

Literatur

• Alberto Diaspro (Hrsg): Confocal and Two-Photon Microscopy: Foundations, Applications and Advances Wiley-Liss,

2001, ISBN 0471409200

• Denk W., Strickler J.H., Webb W.W.: Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.,

Science, Apr. 1990, 6;248(4951):73-6.