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Analyse von primären Aminosäuren

prominence SIL-20ACHT Pretreatment Autosampler

Robert Ludwig - Shimadzu Europa GmbH
Albert-Hahn-Str. 6-10, 47269 Duisburg, Germany

Abb. 1: Aminosäuren-Vorsäulen- Derivatisierungssystem.


Von den über 250 bekannten Aminosäuren sind etwa 25 von praktischem Interesse. Die Hauptanwendungen liegen in der Strukturaufklärung von Proteinen und Peptiden in Biochemie, Qualitätskontrolle, Lebensmittel- und Getränkeindustrie sowie in der Klinischen Chemie für Diagnosezwecke (Biological Fluids).

Aufgrund der geringen Konzentration ist die direkte Detektion der Aminosäuren nicht praktikabel. Mittels Derivatisierung kann die Empfindlichkeit immens gesteigert werden.

Grundsätzlich lassen sich zwei Arten von Derivatisierung unterscheiden:

  • Bei der Nachsäulen-Derivatisierung werden die Aminosäuren erst über die Chromatographiesäule getrennt, und anschließend wird die Derivatisierungsreagenz mittels Reagenzpumpe dem Reaktor hinter der Säule zugefügt
  • Bei der Vorsäulen-Derivatisierung werden die Derivatisierungsreagenzien vor der Injektion und Trennung der Probe beigefügt. Die FMOC- und OPA Vorsäulen-Derivatisierungsmethoden können mit pretreatmentfähigen HPLC-Injektoren automatisiert werden.

Die FMOC-Methode (9-Fluormethylencarbonylchlorid) gestattet die Analyse von primären und sekundären Aminosäuren. Sie hat jedoch den Nachteil, dass die Derivatisierungsreagenz fluoresziert und nach der Trennung innerhalb des Chromatogrammes als Störpeak erscheint.

Abb. 2: Theorie der OPA-Derivatisierung.


Mittels der OPA-Methode (Ortho-Phthaldialdehyd) können primäre Aminosäuren, der Großteil der interessanten Aminosäuren, analysiert werden. Der Vorteil gegenüber der FMOC-Methode ist, dass bei der OPA-Methode Störpeaks innerhalb des Chromatogrammes ausbleiben.

Gegenüber der Vorsäulen-Derivatisierungssysteme liegt der Nachteil der Nachsäulen-Derivatisierungssysteme im höheren technischem Aufwand.

In der folgenden Anwendung wird der SIL-20ACHT Pretreatment Autosampler in der automatischen Vorsäulen-Derivatisierung von primären Aminosäuren getestet.

Theorie der OPA-Derivatisierung (Abbildung 2)

Systemkonfiguration (Abbildung 1)

Vakuumentgaser: DGU-20A5
HPLC-Pumpen: 2 x LC-20AD
Mixer: Variabel 0,5, 1,7 und 2,6 ml
Autosampler: SIL-20ACHT Pre-treatment
Säulenthermostat: CTO-20A
Fluoreszenz-Detektor: RF-10AXL
Systemcontroller: CBM-20A

Säulen:
a) VP-ODS 5 µm 250 x 4,6 mm (mit VP-ODS Vorsäule) für hochauflösende Trennungen
b) XR-ODS 2,2 µm 100 x 4,6 mm / mit Phenomenex Vorsäule C-18 Cartridge System (Schneidring aus Edelstahl!) für schnelle Trennungen

Reagenzien, Mobile Phase und Standard

Mobile Phase:
A: 10 mM Phosphat Puffer pH = 6,8 (0,595 g NaH2PO4/ 0,7098 g Na HPO4)
B: Puffer A/ACN (v/v = 2/1)

Derivatisierungsreagenzien:
Reagenz A: 10 mM Borsäure (pH = 9 mit NaOH)
Reagenz B: 100 mg Phtaldialdehyd (OPA) + 100 µl Mercaptopropionsäure) in 100 ml Messkolben auffüllen mit ACN

Probe:
Sigma Amino Acid Std. A6407 [(2,5 µmol/ml (L-Cystin 1,25 µmol/ml)] - In Wasser gelöst: (V/V) = 1/1000

HPLC-Systemparameter

RF-Detektor:

Anregungswellenlänge: 330 nm
Emissionswellenlänge: 450 nm
Empfindlichkeit: Medium
Gain: 1

Säulenofen: Temperatur: 40°C

Die Applikation wurde mit zwei unterschiedlichen C-18 Trennsäulen durchgeführt. Für schnelle Trennungen wurde die XR-ODS II 4,6 x 100 mm (Abbildung 3) und für hohe Auflösungen wurde die VP-ODS 4,6 x 250 mm (Abbildung 4) verwendet.

HPLC-Parameter für XR-ODS Säule

Flussrate: 2 ml/min
BCONC: 20%

Gradientenprogramm:

13.00 B.Conc 50
17.00 B.Conc 80
18.00 B.Conc 80
18.01 B.Conc 20
20.00 Controller Stop

HPLC-Parameter für VP-ODS Säule

Flussrate: 1 ml/min
BCONC: 5 %

Gradientenprogramm:

50.00 B.Conc 60
55.00 B.Conc 100
60.00 B.Conc 100
60.01 B.Conc 5
65.00 Controller Stop


Abb. 3: Schnelle Trennung mit XR-ODS Säule. Injektionsvolumen 5 µl (2,5 nmol/ml).


Pretreatment-Programm

40 µl Sample + 100 µl Reagenz A + 40 µl Reagenz B, Mixen 3-mal 100 µl, 2 Minuten warten

Abb. 4: Hochauflösende Trennung mit VP-ODS Säule. Injektionsvolumen 10 µl (2,5 nmol/ml).

Bemerkung: Um mit möglichst kleinen Volumina zu arbeiten, wurden konische Reagenzvials verwendet.

 

 

Zusammenfassung

Der SIL-20ACHT Pretreatment erlaubt präzise automatische Vorsäulen-Derivatisierung von primären Aminosäuren mittels OPA-Derivatisierung. Aufgrund seiner Flexibilität lässt er sich jedoch auch zur FMOC-Vorsäulen-Derivatisierung verwenden.

Chromatogramme mit hoher Peakkapazität erfordern sehr präzise Retentionszeiten, um eine einwandfreie Identifikationen zuzulassen, da alle Komponenten mit dem gleichen Wellenlängenpaar gemessen werden und die Identifikation ausschließlich über die Retentionszeiten vorgenommen wird. Mit dem LC-20AD Hochdruckgradientensystem und dem CTO-20A Säulenthermostat wird der Anforderung an präzise Retentionszeiten sowohl für lange als auch für schnelle Gradienten genüge getan.

Bei den in den Abbildungen 3 und 4 gezeigten Chromatogrammen wurde der Fluoreszenzdetektor RF-10AXL mit mittlerer Empfindlichkeit und Gain = 1 betrieben, was zeigt, dass diese Trennungen mit noch weit höherer Empfindlichkeit durchgeführt werden können.

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