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Sepsisdiagnostik: Einfluss der DNA-Extraktion auf die quantitative PCR von Sepsiserregern

Dr. Claudia Disqué
Hochschule Bremerhaven, An der Karlstadt 8, 27568 Bremerhaven

Einführung

Die quantitative PCR (qPCR) ist ein hochsensibles Messverfahren für Bakterien in Untersuchungsmaterialien. Neben dem Einsatz für die Lebensmittelanalyse, Wasserqualitätsbestimmung und Sterilitätsprüfung von pharmazeutischen Produkten liegt eine interessante Anwendungsmöglichkeit in der Diagnostik von Sepsis. Angesichts der Dringlichkeit eines zeitnahen Befundes bei Sepsisverdacht und einer schnellstmöglichen gezielten Therapie ist der Nachweis von pathogenen Mikroorganismen mit der qPCR eine viel versprechende Option. Allerdings sind im Gegensatz zu Viren-Nachweissystemen noch keine standardisierten Assays mit Validierungsdaten für den klinischen Gebrauch verfügbar. Eine gängige Methode ist die qPCR-Reaktion mittels Primern, die an hochkonservierte Regionen auf dem bakteriellen Genom binden, wie im 16S rRNA-Gen. Zur Differenzierung auf höherer taxonomischer Ebene (z. B. Gram-positiv, Gram-negativ) bis zur Gattung oder Art werden Sondenhybridisierungen an variable Regionen im Gen mit anschließender Schmelzpunktanalyse[1,2] oder Sequenzierung des Amplifikats und Online-Datenbankrecherche (z. B. BLAST) verwendet. Bei dem Entwurf von Primern wird Computerunterstützt nach Kreuzreaktionen mit anderen Bakterien gesucht und abschließend im Experiment anhand einer Auswahl an Bakterienstämmen verifiziert[3]. Weniger Beachtung findet in der Diagnostik von Sepsiserregern bisher die Möglichkeit, dass Primer unspezifische Reaktionen mit der humanen DNA eingehen können[4]. Als Konsequenz kann es zu einem Verlust an Sensitivität und Spezifität des Assays kommen.

Dieser Artikel beschäftigt sich den negativen Einflüssen humaner DNA auf den qPCR-Nachweis von Erregern in Blut durch universelle 16S rDNA-Amplifikation und mit einem präanalytischen Verfahren, das die störenden Effekte beseitigt.

Abb. 1: Effekt der Anwesenheit von humaner DNA auf die Amplifikation des 16S rRNA-Gens. In dem Versuch wurde das Primerpaar RWO1/DG74[6] verwendet. In der PCR mit 1 µl P. aeruginosa-DNA (13 pg, entspricht ca. 2000 Genomen) ergab sich ein Produkt von ca. 340 bp (siehe PCR, a), mit humaner DNA (42 ng) ein Produkt von ca. 440 bp (PCR, c), und mit einer Mischung von humaner und bakterieller DNA wurden beide Amplifikationsprodukte gebildet (PCR, b). Die PCR-Produkte wurden sequenziert und über eine BLAST-Datenbank-Recherche analysiert. Während in a) und c) Zuordnungen zu bekannten Genen möglich waren, kam die Analyse in b) aufgrund von Basenüberlagerungen zu keinem Ergebnis.

Humane DNA als Störfaktor für den Nachweis von Bakterien im Blut

Keimzahlbestimmungen in Blut von Sepsispatienten haben ergeben, dass Erreger mit nur wenigen Hundert KBE/ml oder darunter vorkommen[5]. Es kann also je nach Bakterienart ein mehrtausendfacher Massenüberschuss an humaner gegenüber bakterieller DNA vorliegen. Dass humane Sequenzen Primer tatsächlich binden können, zeigt Abb. 1 anhand eines PCR-Laufs mit einem universellen 16S rDNA-Primerpaar.


In diesem Versuch wurde die Situation einer Blutprobe simuliert, in der ein normaler Gehalt an Human-DNA und eine 3.230-fach geringere Menge bakterieller DNA vorlag. Dabei kam es zur Coamplifikation eines Abschnittes eines humanen Genes (HNRPA1 Pseudogen) und des 16S rRNA-Genes des Bakteriums (Abb. 1, siehe PCR, b). Interessant zu beobachten war, dass mit weiterer Abnahme der bakteriellen DNA die humane Bande stärker wurde, also die Amplifikation des unspezifischen Signals immer weiter überwog (nicht gezeigt). Ähnliche Resultate wurden mit einem anderen Primerpaar[3] erzielt (nicht gezeigt). Bei der Sequenzierung waren Bandenüberlagerungen zu beobachten (Abb. 1, b), die eine Identifizierung über Datenbankrecherche unmöglich machten. Es ist also damit zu rechnen, dass 1) Kreuzreaktionen der Primer mit humanen Sequenzen zu einem unspezifischen Amplifikat und damit zum Verlust an Spezifität führen und 2) falsch-positive Befunde entstehen können, wenn humane Sequenzen in Abwesenheit von Bakterien amplifiziert werden (Abb. 1, siehe PCR und Sequenzierung, c).

Abb. 2: qPCR (Mastermix 16S Complete, Molzym) über 40 Zyklen mit verschiedenen Mengen an P. aeruginosa-DNA bzw. mit P. aeruginosa-DNA und einer konstanten Menge an humaner DNA (42 ng). Cutoff: Negative Kontrolle mit Wasser anstatt Template-DNA. Als Ergebnis wurde in Anwesenheit von humaner DNA eine Verschiebung zu niedrigeren C(t)-Werten und damit ein Verlust an Nachweisempfindlichkeit beobachtet.

Binden die Primer in größerem Abstand zueinander oder in die gleiche Richtung an humane DNA, entsteht kein doppelsträngiges Amplifikat. Als Konsequenz kann es zu einer Austitrierung der Primer und damit zu einer limitierenden Menge für die spezifische Amplifikation bakterieller Sequenzen kommen. Dieser Effekt wird anhand eines Experimentes mit Mischungen reiner DNAs deutlich (Abb. 2). Es fällt auf, dass die Anwesenheit humaner DNA die C(t)-Werte im Mittel um 7,7 Einheiten verschob oder umgerechnet die Detektion des Erregers um ca. zwei Zehnerpotenzen unempfindlicher machte. Unspezifische Bindung von Primern kann also zu einem Verlust an Sensitivität des Bakteriennachweises im Assay führen.

 

Effekt der DNA-Präparationsmethode auf die qPCR

Dem negativen Effekt humaner DNA auf die 16S rDNA qPCR könnte durch eine gezieltere Konstruktion von Primern für bakterielle Targets entgegengewirkt werden. Allerdings gibt es hier Einschränkungen durch die begrenzte Zahl an konservierten Bereichen im 16S oder auch 23S rRNA-Gen. Eine andere Strategie ist, die humane DNA im präanalytischen Vorfeld zu beseitigen und damit nicht erst in die PCR eingehen zu lassen. Dieser Ansatz wird mit einem Verfahren (MolYsis, Molzym) verfolgt, in dem die Blutzellen lysiert, die freigesetzte humane DNA degradiert, die Erregerzellen angereichert und durch ein Reagenz lysiert werden. Im Anschluss wird die bakterielle DNA über gängige DNA-Reinigungsverfahren isoliert.

Tabelle 1: Effekt der DNA-Präparationsmethode auf die Detektionssensitivität von S. aureus in Vollblut mit einer generellen 16S rDNA quantitativen PCR (Mastermix 16S Complete, Molzym).


Verschiedene Kits wurden verwendet, um DNA aus Blut zu isolieren, das mit Verdünnungen einer Staphylococcus aureus-Kultur vermischt wurde. DNA-Extrakte wurden in einem universellen16S rDNA-Assay (Mastermix 16S Complete, Molzym) für die Detektion der Bakterien eingesetzt. Im Vergleich zu Gesamt-DNA-Extrakten (Tab. 1 A) wurden mit MolYsis (Tab. 1 B-D) erhebliche Steigerungen der Nachweisempfindlichkeit erreicht. Je nach Blutprobenvolumen und verwendetem DNA-Reinigungskit wurde eine bis zu 20.000-fach höhere qPCR-Sensitivität beobachtet. Auch bei Gram-negativen Sepsis-Erregern wie Pseudomonas aeruginosa und Escherichia coli war die qPCR-Detektion empfindlicher, wenn die humane DNA abgebaut war (MolYsis Basic-Kit mit QiaAmp-Kit kombiniert aus 0,2 ml Blut: 10 bzw. 100-fach; nicht gezeigt).

Abb. 3: Einfluss der Beseitigung humaner DNA auf den Nachweis von Erregern in Blutproben (0.2 ml) von zwei septischen Patienten (A, C bzw. B, D). 16S-23S rDNA Intergenic Spacer PCR-Analyse[7]. Rote Pfeile: Signale aus der Amplifikation humaner Sequenzen in Gesamt-DNA-Extrakten (QiaAmp, Qiagen); blaue Pfeile: Signale bakterieller Sequenzen mit Extrakten, die von humaner DNA abgereichert wurden (MolYsis+QiaAmp)Nachweisempfindlichkeit beobachtet.


Das Verfahren wurde an natürlichen Proben getestet (Abb. 3). Aus 0,2 ml Blut von Patienten mit SIRS (systemisch inflammatorisches Response Syndrom) wurde Gesamt-DNA (QiaAmp) bzw. Erreger-DNA (MolYsis Basic plus QiaAmp) extrahiert und in einer 16S-23S rDNA intergenic spacer PCR analysiert. Mit Gesamtextrakten kam eine Vielzahl von Banden zum Vorschein, die offenbar aus der Amplifikation der humanen DNA stammten. Wurde die humane DNA verdaut (MolYsis plus QiaAmp), verschwanden die anders beobachteten Banden und drei neue erschienen. Dieser beobachtete Bandenpolymorphismus wies im Vergleich mit dem aus Reinkulturen erhaltenen Muster auf die Anwesenheit von S. aureus in beiden Blutproben (nicht gezeigt).

 

Fazit

Die präanalytische Beseitigung humaner DNA erwies sich als leistungsfähige und vielversprechende Methode für die qPCR-Detektion von Sepsiserregern in Blut. Klinische Studien im Vergleich mit der Blutkulturdiagnostik müssen zeigen, ob dieses Verfahren Anwendung für die Sepsisdiagnostik finden kann.

Literatur

[1] Klaschik, S., Lehmann, L.E., Raadts, A., Book, M., Gebel, J., Hoeft, A., Stuber, F. (2004): Detection and differentiation of in vitro-spiked bacteria by real-time PCR and melting curve analysis. J. Clin. Microbiol. 42: 512-517

[2] Klausegger, A., Hell, M., Berger, A., Zinober, K., Baier, S., Jones, N., Sperl, W., Kofler, B. (1999): Gram type-specific broad-range PCR amplification for rapid detection of 62 pathogenic bacteria. J. Clin. Microbiol. 37: 464-466

[3] Nadkarni, M.A., Martin, F.E., Jacques, N.A., Hunter, N. (2002): Determination of bacterial load by real-time PCR using broad-range (universal) probe and primers set. Microbiology 148: 257-266

[4] Navarro, E., Escribano, J., Fernández, J.A., Solera, J. (2002): Comparison of three different PCR methods for detection of Bucella spp. in human blood samples. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 34: 147-151

[5] Philipps, S.E., Bradley, J.S. (1990): Bacteremia detected by lysis direct plating in a neonatal intensive care unit. J. Clin. Microbiol. 28: 1-4

[6] Greisen, K., Loeffelholz, M., Purohit, A., Leong, D. (1994): PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid. J. Clin. Microbiol. 32: 335-351

[7] Mendoza, M., Meugnier, H., Bes, M., Etienne, J., Freney, J. (1998): Identification of Staphylococcus species by 16S-23S rDNA intergenic spacer PCR analysis. Int. J. Syst. Bacteriol. 48: 1049-1055

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