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Automatisierte NGS-Probenvorbereitung

Einfache Präparation mehrerer Proben gleichzeitig mit minimalem Aufwand und erhöhter Ausbeute

Erin Ferguson, Svetlana Jasinovica,Dr. Michael Lodes, and Curtis Knox, Lucigen Corporation,
Middleton, WI, USA;
Dr. Claudia Allritz, Gilson International BV Deutschland, Limburg-Offheim

Angesichts der zunehmenden Anzahl zu sequenzierender Proben bedarf es einer automatisierten Probenvorbereitung von DNA-Bibliotheken, die dem hohen Durchsatz von Next-Generation-Sequencing (NGS)-Instrumenten gerecht wird. Um eine genaue Analyse der NGS-Technologien zu gewährleisten, ist eine effiziente und konsistente Präparation von DNA-Bibliotheken essentiell.

Der hier verwendete NxSeq® DNA-Kit (Lucigen) wurde entwickelt, um den Zeitaufwand
der gesamten NGS-Probenvorbereitung zu reduzieren und um die Polyadenylierung
sowie die nachgeschaltete Ligation der Fragmente an die Adapter zu verbessern. Ein
optimierter Mastermix von Enzymen und Puffern ermöglicht die DNA-End-Reparatur und
die Polyadenylierung von DNA-Fragmenten in nur einem Reaktionsgefäß. Mehrfache
Waschschritte während des Prozesses sind nicht notwendig.

Der von Gilson entwickelte PIPETMA X ist eine einfach zu bedienende Plattform mit
intuitiver Software, die zur Automatisierung von manuellen Pipettierschritten dient und
für eine Vielzahl von anwenderspezifischen Methoden entwickelt wurde. Der PIPETMAX kann gleichzeitig mit zwei Pipettierköpfen arbeiten, die einfach von Hand wechselbar
sind. Je nach Anwendung können verschiedene Plattenformate ausgewählt werden.
Durch das bewegliche XYZ-System können auch gezielt 384-well-Platten angesteuert
werden. Ein steriles Arbeiten ist durch den abnehmbaren Deckel unter einer Abzugshaube
möglich.

Ergebnisse

Die Daten zeigen eine korrekte Assemblierung der DNA-Bibliothek, deren Peak im Vergleich zur nicht ligierten, gescherten DNA 150 bp (±20) nach rechts verschoben beginnt (Abb.1 A). Bei einer ausbleibenden Ligation der Adapter an die Zielsequenz wären die Proben auf einer oder auf beiden Seiten der Peaks überlagert.

Im Vergleich zur manuellen Probenvorbereitung sind die Proben, die mit dem PIPETMAX
pipettiert wurden, konsistenter und von größerer Ausbeute (Abb. 1B).

Damit die nachgeschaltete NGS-Amplifikation erfolgreich verläuft, ist eine effiziente
Ligation der Adapter an die Zielsequenz wichtig. Die Ligationseffizienzen der manuellen
Probenvorbereitung und der automatisierten Probenvorbereitung mit dem PIPETMAX sind
vergleichbar.

Zusammenfassung

Die automatisierte NxSeq® Probenvorbereitung mit dem PIPETMAX®268 ermöglicht im Vergleich zur manuellen Probenvorbereitung eine einfache Präparation mehrerer Proben gleichzeitig mit minimalem Aufwand, erhöhter Ausbeute und konsistenteren Proben. Die Adapter-Ligationseffizienzen sind vergleichbar mit denen einer manuellen Probenvorbereitung, das heißt, die Gesamtqualität der NxSeq® DNA-Bibliotheken wird durch die Verwendung des PIPETMAX nicht beeinträchtigt.

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