Oberflächenfunktionalisierung von Goldschichten zur gerichteten Immobilisierung von Biomolekülen

Einleitung

Die Aufgabe der Biosensorik ist es, spezifische Informationen über die biochemische Zusammensetzung von Analysenproben in Echtzeit zu liefern. Die dafür eingesetzten Sensoren sind miniaturisierte Analysesysteme, bei denen die biologische Erkennungsstruktur und der Signalwandler (Transducer) eng miteinander gekoppelt sind [1]. Durch die spezifische Interaktion der Erkennungsstruktur mit dem Analyten wird ein physikochemisches Signal erzeugt, vom Transducer aufgenommen und in ein elektrisches Signal umgewandelt. Die Messwerte können anschließend mittels einer geeigneten Computer-Software verarbeitet und in einen physikalischen Parameter umgewandelt werden, der den untersuchten Prozess beschreibt [1]. Die Sensoren werden in der Regel hinsichtlich ihrer Signalwandlung unterschieden. Es gibt kalorimetrische, elektrochemische (amperometrische und potentiometrische), optische und akustische (piezoelektrische) Biosensoren [2]. Zudem ist auch eine Klassifizierung über die biologische Erkennungsstruktur möglich. Es werden unter anderem Enzyme, Aptamere, Antikörper, Mikroorganismen, Zellorganellen sowie pflanzliche oder tierische Gewebestücke als biogene Sensorbestandteile verwendet [3].

Biosensoren werden sehr vielfältig eingesetzt. So finden sie beispielsweise in der klinischen Diagnostik, der Umweltanalytik, der Militärtechnik, der Lebensmittelanalytik und der Prozesskontrolle Anwendung.

Dabei werden die Erkennungsstrukturen oder Fängermoleküle häufig mit optischen oder elektrochemischen Sensoren kombiniert, um die Konzentration eines Analyten in Echtzeit, ohne ein zusätzliches Reagenz messen zu können.

Aufgrund von zahlreichen Vorteilen, wie der zerstörungsfreien Arbeitsweise und der schnellen Signalgenerierung, bilden die optischen Methoden die größte Gruppe der Transducer. Sie messen Veränderungen in der Adsorption, Fluoreszenz, Lumineszenz, Lichtstreuung oder des Brechungsindexes. Die Detektion kann, wie auch bei den anderen Transducer-Typen, entweder direkt oder indirekt erfolgen. Bei der direkten Variante wird die physikalische Veränderung, hervorgerufen durch die Bildung eines Komplexes, ohne zusätzliche Modifizierung der Reaktionspartner gemessen. Der Analyt liegt frei und unverändert in der Lösung vor. Bei der indirekten Methode wird ein Label benötigt, welches das zu messende Signal generiert. Als Label werden häufig Enzyme (z. B. Peroxidase) oder fluoreszierende Stoffe (z. B. Fluorescein) eingesetzt. Das heißt aber auch, dass eine zusätzliche Modifizierung der Reaktionspartner notwendig ist. Das kann, wie jede chemische Veränderung, den Analyt und damit die gewünschte Interaktion beeinflussen. Demgegenüber steht eine höhere Sensitivität, hervorgerufen durch die chemischen Eigenschaften des Labels. So können mit der indirekten Arbeitsweise beispielsweise Probleme bei der Detektion von Molekülen mit geringem Molekulargewicht umgangen werden [2].

Die Sensitivität eines Biosensors hängt in erster Linie von den verwendeten Liganden ab [2]. Obwohl Antikörper als hochaffine Moleküle am häufigsten zum Einsatz kommen, stoßen sie dennoch schnell an ihre Grenzen. So werden bereits alternative Moleküle eingesetzt, die die Probleme und Einschränkungen von Antikörpern umgehen [2,4]. Eine der vielversprechendsten Varianten sind Aptamere [5–7]. Dabei handelt es sich um kurze, einzelsträngige Oligonukleotide (RNA oder DNA), die ihr Zielmolekül mit einer hohen Affinität und Selektivität binden. Sie werden im Gegensatz zu Antikörpern nicht im lebenden Organismus, sondern chemisch synthetisiert [2,5,7]. Ein weiterer entscheidender Vorteil von Aptameren ist, dass sie im Gegensatz zu Antikörpern einfach modifiziert werden können und dass eine Immobilisierung oder Markierung ihre Affinität nicht beeinflusst [5,7]. Trotz dieser und noch weiterer Vorteile können sie Antikörper derzeit nicht vollständig ersetzen. So begrenzt zum einen ihre Nuklease-Empfindlichkeit den Einsatz, zum anderen steht die Entwicklung von Aptameren noch am Anfang [2].

Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)

Die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Spektroskopie gehört zu den bevorzugt einge­setzten, optischen Methoden, da sie Wechselwirkungen zwischen zwei Reaktionspartnern auf der Grundlage von Brechungsindex-Änderungen in Echtzeit labelfrei messen kann. Die Detektion des Brechungsindex erfolgt dabei innerhalb eines evaneszenten Feldes, welches sich an der Grenzfläche zwischen einem Metall (Gold) und einem Dielektrikum (Puffer) ausbildet. Für die Messung wird einer der beiden Reaktionspartner auf der Metalloberfläche immobilisiert und mit dem zweiten, gelösten Reaktionspartner über das angrenzende Dielektrikum in Kontakt gebracht.

Immobilisierungsstrategien

Viele Biosensoren und -assays basieren auf der Anbindung der Fängermoleküle an feste Oberflächen [8]. Aufgrund der Immobilisierung und der damit einhergehenden räumlichen Hinderung durch die feste Oberfläche sowie wegen der zufälligen Orientierung der Biomoleküle verringert sich häufig ein Teil der Bindungsaktivität der Fängermoleküle [8,9]. Um eine möglichst hohe Sensitivität des jeweiligen Sensors zu gewährleisten, ist es erforderlich, eine geeignete Immobilisierungsstrategie auszuwählen [8]. Vor allem für Messungen in Realproben ist es entscheidend, dass die funktionalisierte Fläche eine ausreichend hohe Immobilisierungsdichte und eine genügend hohe Bindungsaktivität besitzt, um auch Analyten in geringen Konzentrationen detektieren zu können [10]. Eine weitere wichtige Voraussetzung für die Entwicklung eines sensitiven Biosensors ist das Blocken freier Bereiche der Sensoroberfläche, um unspezifischer Bindungen der verschiedenen Probenbestandteile zu vermeiden. Zusätzlich sollte stets eine Referenzfläche parallel untersucht werden. So können, der Anteil an unspezifischer Bindung sowie Puffereffekte abgeschätzt werden [10]. Folglich muss die Referenzfläche so identisch wie möglich zur Messfläche sein. Im Idealfall werden demzufolge auf der Referenzfläche Moleküle ohne Affinität zu dem entsprechenden Antigen oder den anderen Serumbestandteilen auf die gleiche Weise wie die sensitiven Fängermoleküle immobilisiert [10].

In vielen Biosensoren sind die Sensorchips regenerierbar und ermöglichen damit mehrere reproduzierbare Bindungszyklen [2,11]. Dazu wird eine geeignete Lösung injiziert, welche im Idealfall die Analyten von den Fängermolekülen entfernt, ohne letztere zu zerstören.

Die Biomoleküle können generell über Physisorption, Fc-bindende Proteine, Crosslinker,  kovalente Bindungen, Self-assembled Monolayers (SAM) oder eingebettet in Matrices auf die Goldoberfläche eines SPR-Chips immobilisiert werden [9,11,12].

Die Physisorption ist eine der einfachsten Methoden, mit der eine große Menge an Biomolekülen auf eine Oberfläche aufgebracht werden kann [11]. Allerdings besteht die Gefahr, dass die Sekundärstruktur der Proteine durch den direkten Kontakt zur Goldfläche gestört wird [13,14]. 

Eine Orientierung von Antikörpern ist über die Immobilisierung mittels Fc-bindenden Proteinen, wie Protein A oder G, möglich [9,14,15]. Protein A ist ein ca. 64 kDa großes Zellwandprotein von Staphylococcus aureus, das vier Bindungsstellen für den Fc-Bereich von Immunoglobulinen vieler Wirbeltiere besitzt, im Gegensatz zu Protein G mit zwei Bindungsstellen [9,15]. Zudem bildet es einen Spacer zwischen den Antikörpern und der Goldfläche aus. Darüber hinaus besitzt Protein A eine weitere wichtige Eigenschaft, die vor allem bei der Aufreinigung von Antikörpern genutzt wird. Es ist die Regenerierbarkeit bei niedrigen pH-Werten [15].

Crosslinker, wie beispielsweise 3,3-Dithiobis(sulfosuccinimidylpropionat) (DTSSP), können in Kombination mit Fc-bindenden Proteinen oder als Monolayer verwendet werden [16,17]. DTSSP besteht aus einer Kette mit acht Kohlenstoffatomen, an dessen Enden sich jeweils ein N-Hydroxysulfosuccinimid-Ester befindet. Dort können sich primäre Amine kovalent anbinden [18]. Die Bindung an Gold wird über die im Spacer-Arm enthaltene Disulfidbrücke realisiert. Bei der Verwendung von DTSSP-Monolayern steht dem Vorteil der kovalenten Anbindung der Biomoleküle ihre zufällige Orientierung gegenüber, da Proteine meist mehrere primäre Amine enthalten.

Eine gerichtete Immobilisierung der Biomoleküle kann erreicht werden, indem zunächst Protein A auf die DTSSP-Schicht gegeben wird und anschließend die Immobilisierung der Antikörper erfolgt [16]. Zudem verhindert diese Immobilisierungsvariante eine mögliche Denaturierung des Protein A durch den direkten Kontakt mit der Goldoberfläche [13].

SAMs eignen sich besonders, um den Kontakt der Liganden mit der Goldfläche und die unspezifische Anbindung von Probenbestandteilen zu minimieren [2]. Zudem weisen SAM-basierte Proteinchips häufig eine hohe Stabilität in extremen pH- und Temperaturbereichen auf [8]. Über eine endständige Funktionalisierung können die Biomoleküle stabil an die Monolayer angebunden werden [8].

Eine Möglichkeit für eine endständige Ankopplungsstelle bildet die Biotin-Streptavidin-Bindung, da sie sich schnell ausbildet und in weiten pH- und Temperaturbereichen stabil ist [10,14,19,20]. Die Biotin-Streptavidin-Bindung ist eine der stärksten nicht-kovalenten biologischen Bindungen (Dissoziationskonstante 4∙10^-14 mol/L) [20]. Die Grundlage der Monolayer bilden häufig Alkanthiole oder Polyethylenglykole (PEG) [2,8,10–14,19,21,22]. PEG ist ein Polymer, das für seine proteinabweisenden Eigenschaften bekannt ist und sich daher besonders als Bestandteil der Funktionalisierung von Proteinchips, auf denen Realproben vermessen werden, eignet [10,19,21,23].

Das wohl bekannteste Beispiel für Matrices auf SPR-Sensorchips ist die carboxymethylierte Dextran-Schicht, die auf den etablierten SPR-Chips von Biacore verwendet werden [8,24]. Ähnlich wie PEG bildet Dextran eine hydrophile Schutzschicht zwischen dem Gold und den Biomolekülen und verhindert so unspezifische Anbindungen über hydrophobe Wechsel­wirkungen sowie den direkten, meist denaturierenden, Kontakt der Erkennungsstruktur mit der Goldoberfläche [24]. Über die 3D-Struktur des Dextrans kann eine höhere Immobilisierungsdichte als bei eindimensionalen Funktionalisierungen erreicht werden. Die Immobilisie­rung der Antikörper erfolgt meist kovalent über Thiol-, Aldehyd-, Amin- oder Carboxyl­gruppen und ist somit ungerichtet [8].

Das ^liSPR-System

Am Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik TU Dresden steht das ^liSPR-System (capitalis technology GmbH, Berlin, Deutschland) zur Verfügung [25]. Es stellt ein miniaturisiertes System dar, welches das simultane Charakterisieren einer Probe mit zahlreichen Bindungspartnern ermöglicht [25–27] und besteht aus einem Spektrometer mit dazugehöriger Software, einem Probenhandlingsystem sowie einem lab-on-a-chip System, zusammengesetzt aus einer temperierbaren On-Chip-Mikrofluidik und den entsprechenden Sensorchips (Abb. 1).

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Abb. 1 Links: SPR-Spektrometer mit Sensorchip und On-Chip-Mikrofluidik. In Schwarz die Halterung zur Arretierung des lab-on-a-chip Systems im Spektrometer. Rechts: Das lab-on-a-chip System als Explosionsdarstellung: (1) Temperierung, (2) Vakuumanschlüsse, (3) Fluidikanschlüsse, (4) Flusszelle, (5) Fluidikkanal, (6) Vakuumkammern, (7) Goldfläche und (8) SPR-Chip [28].

Das ^liSPR-System misst im Gegensatz zu den gängigen Biacore-Systemen Winkeländerungen bei einer konstanten Wellenlänge von 810 nm. Dabei wird das Licht der LED kollimiert auf die Sensorchips geleitet und durch integrierte optische Elemente auf die Unterseite der Goldfläche fokussiert, wodurch je nach Brechungsindex des anliegenden Mediums bei einem bestimmten Einfallswinkel Oberflächenplasmonen angeregt werden. Das reflektierte Licht wird über die integrierten Linsensysteme wieder kollimiert und von einer CCD-Kamera aufgenommen. Mittels Bildverarbeitung und Fitting-Algorithmen wird die minimalste Reflektion für jede Messfläche bestimmt. Das ^liSPR-Gerät verfügt über drei separat ansteuerbare LED. Damit können bis zu drei unterschiedliche Goldbereiche (9 x 0,8 mm²) gleichzeitig vermessen werden [25].

Mittels der in die On-Chip-Mikrofluidik eingebrachten Vakuumkammern wird der SPR-Chip vor der Messung durch Unterdruck an der Messflusszelle aus Polydimethylsiloxan (PDMS) fixiert.

Die Sensorchips werden mittels Spritzguss aus TOPAS® als objektträgergroße Einwegartikel (76 x 26 x 4 mm³) gefertigt.

In der Mitte des Chips befindet sich eine 50 nm dicke, 12 x 3 mm² große, rechteckige Goldschicht, welche den sensitiven Bereich bildet. Die optischen Elemente sind unterhalb der Goldfläche direkt in den Chip integriert. Diese kompakte Bauweise ermöglicht eine justage-unkritische Kopplung zum Auslesegerät.

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Abb. 2a: Piezoelektrische Mikropipette des Nano-PlotterTM beim Spotten von Biomolekülen auf die Goldfläche der Sensorchips [27].

Der zu untersuchende Reaktionspartner kann über inverses Mikrokontaktdrucken mit Hilfe einer 17-Kanal-Flusszelle aus PDMS auf die Goldschicht aufgebracht werden. Für die Im­mobilisierung werden die Kanäle mit je 5 μL Probe befüllt und unter den gewünschten Bedingungen inkubiert. Eine weitere Mög­lichkeit zum Aufbringen von Biomolekülen auf den Sensorchip bietet der Nano-Plotter^TM (GeSiM mbH) [26,27]. Dieser piezoelektrische Dispenser spottet präzise abgemessene, wenige Nanoliter große Tröpfchen der Analysesubstanzen in einem definierten Array auf die Goldfläche, auf der so bis zu 180 Messflächen mit kleinsten Probenvolumen realisiert werden können. Damit besteht die Möglichkeit, eine Vielzahl verschiedener Liganden zeitgleich zu testen, was die Analysen erheblich beschleunigt und die Kosten senkt.

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Abb. 2b: Nano-PlotterTM (GeSiM mbH) mit eingelegten Sensorchips.

Applikationen

Am Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik TU Dresden wird das ^liSPR-System für verschiedenste Applikationen im diagnostischen und analytischen Bereich eingesetzt und weiterentwickelt. Nachfolgend werden beispielhaft zwei erfolgreich am Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik durchgeführte Projekte etablierte Applikationen vorgestellt.

Anti-Virus Antikörper

Das Ziel des Projektes ist war es, einen Sensorchip zu entwickeln, mit dessen Hilfe Realproben auf das Vorhandensein von Pflanzenviren (Soil Borne Cereal Mosaic Virus (SBCMV)) mittels des ^liSPR-Spektrometers untersucht und auch quantitative Aussagen erhalten werden können [29]. Dazu wurde ein polyklonaler Antikörper ausgewählt, der spezifisch an den Pflanzenvirus bindet.

Der Antikörper sollte mittels einer geeigneten Methode möglichst funktionell und stabil auf die Goldfläche immobilisiert werden, um Konzentrationsreihen zu vermessen. Dazu wurde er über Protein A gerichtet auf die Goldoberfläche aufgebracht. Noch freie sensitive Bereiche wurden anschließenden mit PEG geblockt. 

Als Referenz wurde ein Antikörper (Referenz-Ak) ohne Affinität zu dem entsprechenden Antigen oder den Serumbestandteilen auf die gleiche Weise wie der Detektionsantikörper immobilisiert.

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Abb. 3 Sensorgramm der SBCMV-Konzentrationsreihe (von unten nach oben: 0,7 µg/mL; 1,4 µg/mL; 2,9 µg/mL; 5,8 µg/mL; 11,6 µg/mL; 23,1 µg/mL; 46,2 µg/mL und 92,5 µg/mL) auf SBCMV-pAk funktionalisierten Flächen. Die Signale des Referenz-Ak wurden von den Bindungssignalen abgezogen.

Zur Ermittlung einer Nachweisgrenze und Erstellung der Kalibrierungskurven wurden Viruskonzentrationen von 0,7 µg/mL bis 92,5 µg/mL – enspricht in etwa den gefundenen Detektionsgrenzen – online auf zuvor nach dem erarbeiteten Immobilisierungsprotokoll funktionalisierten Chips injiziert. Die Antikörper-Flächen wurden nach jeder Bindung mit einem pH-Schock (pH 13) regeneriert. Die Sensorgramme ausgewählter Konzentrationen sind in Abbildung 3 dargestellt.

Die ermittelte Nachweisgrenze liegt bei ca. 0,9 µg/mL [29]. Damit konnte ein Immunosensor zur Detektion von phytopathogenen Viruspartikeln etabliert werden, der höhere Sensitivitäten im Vergleich zu anderen Funktionalisierungsprotokollen aufweist [24,31].

Aptamer-Chip zum Nachweis von humanem Thrombin

Der Nachweis toxischer, letaler oder schwach immunogener Substanzen gestaltet sich oft schwierig, da passende Antikörper häufig nicht verfügbar sind. Deshalb werden am Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik TU Dresden verstärkt Aptamer eingesetzt. Diese synthetisch hergestellte, einzelsträngige Nukleinsäure-Oligomere (ssDNA oder ssRNA) binden ihr Zielmolekül mit einer vergleichbaren oder sogar besseren Selektivität, Spezifität und Affinität als Antikörper. Des Weiteren können sie einfach und zielgerichtet chemisch modifiziert werden. Durch direkte Immobilisierung von Aptameren über einen endständig gekoppelten Linker lässt sich auf einfache Art und Weise eine spezifisch reaktive und gerichtete Sensorfunktionalisierung realisieren. Diese sind strukturell wesentlich stabiler als Antikörper-basierte Sensorchips und lassen sich demnach leichter handhaben.

Das Ziel dieses Projektes ist war es, ein Protokoll für Aptamer-Protein- Interaktionen anhand eines Modellsystems zu etablieren. Dazu wurden Aptamere ausgewählt, die spezifisch Thrombin bindet. Die biotinylierten Aptamere wurden über Streptavidin gerichtet auf die Goldoberfläche aufgebracht. Noch freie sensitive Bereiche wurden anschließenden mit BSA geblockt.

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Abb. 4 Sensorgramm der Thrombin-Konzentrationsreihe (von unten nach oben: 0 nmol/L, 26,25 nmol/L, 39,37 nmol/L, 52,5 nmol/L, 78,75 nmol/L, 105 nmol/L, 157,5 nmol/L, 210 nmol/L, 315 nmol/L und 420 nmol/L) auf mit Anti-Thrombin Aptamer funktionalisierten Flächen. Die Signale des Referenz-Aptamers wurden von den Bindungssignalen abgezogen [28].

Zur Abschätzung der Spezifität der detektierten Signale ist ein Referenzkanal unabdingbar. Ein Referenz-Aptamer, das keine Affinität zu dem entsprechenden Antigen oder den Serumbestandteilen besitzt, wurde auf die gleiche Weise wie das Anti-Thrombin Aptamer immobilisiert.

Zur Ermittlung einer Nachweisgrenze und Erstellung der Kalibrierungskurven wurden Thrombin-Konzentrationen von 0 nmol/L bis 420 nm online auf zuvor nach dem erarbeiteten Immobilisierungsprotokoll funktionalisierten Chips injiziert (Abb. 4). Die Aptamer-Flächen wurden nach jeder Bindung mit einem 1 mol/L NaCl regeneriert.

Die ermittelte Nachweisgrenze liegt bei einer Thrombin-Konzentration von 26 nmol/L [28].

Zusammenfassung und Ausblick

Die SPR-Spektroskopie gehört zu den bevorzugt eingesetzten Detektionsmethoden in der Biosensorik, da sie Veränderungen des Brechungsindexes, hervorgerufen durch die Bildung des Immun­komplexes, ohne zusätzliche Modifizierung der Reaktionspartner erfassen kann.

Eine der größten Herausforderungen ist dabei die Auswahl geeigneter Strategien zur Immobi­lisierung der jeweiligen Fängermoleküle an die Sensorfläche als Voraussetzung für die nach­fol­gende, spezifische Bindung des nachzuweisenden Analyten. In diesem Kontext werden am Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik verschiedene Möglichkeiten zur Oberflächenmodifikationen (von 2D bis 3D) für die kontinuierliche SPR-basierte Über­wachung von Fermentations- und Kultivierungsprozessen erarbeitet und untersucht.

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