Einleitung
Die Aufgabe der Biosensorik ist es, spezifische Informationen über die biochemische Zusammensetzung von Analysenproben in Echtzeit zu liefern. Die dafür eingesetzten Sensoren sind miniaturisierte Analysesysteme, bei denen die biologische Erkennungsstruktur und der Signalwandler (Transducer) eng miteinander gekoppelt sind [1]. Durch die spezifische Interaktion der Erkennungsstruktur mit dem Analyten wird ein physikochemisches Signal erzeugt, vom Transducer aufgenommen und in ein elektrisches Signal umgewandelt. Die Messwerte können anschließend mittels einer geeigneten Computer-Software verarbeitet und in einen physikalischen Parameter umgewandelt werden, der den untersuchten Prozess beschreibt [1]. Die Sensoren werden in der Regel hinsichtlich ihrer Signalwandlung unterschieden. Es gibt kalorimetrische, elektrochemische (amperometrische und potentiometrische), optische und akustische (piezoelektrische) Biosensoren [2]. Zudem ist auch eine Klassifizierung über die biologische Erkennungsstruktur möglich. Es werden unter anderem Enzyme, Aptamere, Antikörper, Mikroorganismen, Zellorganellen sowie pflanzliche oder tierische Gewebestücke als biogene Sensorbestandteile verwendet [3].
Biosensoren werden sehr vielfältig eingesetzt. So finden sie beispielsweise in der klinischen Diagnostik, der Umweltanalytik, der Militärtechnik, der Lebensmittelanalytik und der Prozesskontrolle Anwendung.
Dabei werden die Erkennungsstrukturen oder Fängermoleküle häufig mit optischen oder elektrochemischen Sensoren kombiniert, um die Konzentration eines Analyten in Echtzeit, ohne ein zusätzliches Reagenz messen zu können.
Aufgrund von zahlreichen Vorteilen, wie der zerstörungsfreien Arbeitsweise und der schnellen Signalgenerierung, bilden die optischen Methoden die größte Gruppe der Transducer. Sie messen Veränderungen in der Adsorption, Fluoreszenz, Lumineszenz, Lichtstreuung oder des Brechungsindexes. Die Detektion kann, wie auch bei den anderen Transducer-Typen, entweder direkt oder indirekt erfolgen. Bei der direkten Variante wird die physikalische Veränderung, hervorgerufen durch die Bildung eines Komplexes, ohne zusätzliche Modifizierung der Reaktionspartner gemessen. Der Analyt liegt frei und unverändert in der Lösung vor. Bei der indirekten Methode wird ein Label benötigt, welches das zu messende Signal generiert. Als Label werden häufig Enzyme (z. B. Peroxidase) oder fluoreszierende Stoffe (z. B. Fluorescein) eingesetzt. Das heißt aber auch, dass eine zusätzliche Modifizierung der Reaktionspartner notwendig ist. Das kann, wie jede chemische Veränderung, den Analyt und damit die gewünschte Interaktion beeinflussen. Demgegenüber steht eine höhere Sensitivität, hervorgerufen durch die chemischen Eigenschaften des Labels. So können mit der indirekten Arbeitsweise beispielsweise Probleme bei der Detektion von Molekülen mit geringem Molekulargewicht umgangen werden [2].
Die Sensitivität eines Biosensors hängt in erster Linie von den verwendeten Liganden ab [2]. Obwohl Antikörper als hochaffine Moleküle am häufigsten zum Einsatz kommen, stoßen sie dennoch schnell an ihre Grenzen. So werden bereits alternative Moleküle eingesetzt, die die Probleme und Einschränkungen von Antikörpern umgehen [2,4]. Eine der vielversprechendsten Varianten sind Aptamere [5–7]. Dabei handelt es sich um kurze, einzelsträngige Oligonukleotide (RNA oder DNA), die ihr Zielmolekül mit einer hohen Affinität und Selektivität binden. Sie werden im Gegensatz zu Antikörpern nicht im lebenden Organismus, sondern chemisch synthetisiert [2,5,7]. Ein weiterer entscheidender Vorteil von Aptameren ist, dass sie im Gegensatz zu Antikörpern einfach modifiziert werden können und dass eine Immobilisierung oder Markierung ihre Affinität nicht beeinflusst [5,7]. Trotz dieser und noch weiterer Vorteile können sie Antikörper derzeit nicht vollständig ersetzen. So begrenzt zum einen ihre Nuklease-Empfindlichkeit den Einsatz, zum anderen steht die Entwicklung von Aptameren noch am Anfang [2].
Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)
Die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Spektroskopie gehört zu den bevorzugt eingesetzten, optischen Methoden, da sie Wechselwirkungen zwischen zwei Reaktionspartnern auf der Grundlage von Brechungsindex-Änderungen in Echtzeit labelfrei messen kann. Die Detektion des Brechungsindex erfolgt dabei innerhalb eines evaneszenten Feldes, welches sich an der Grenzfläche zwischen einem Metall (Gold) und einem Dielektrikum (Puffer) ausbildet. Für die Messung wird einer der beiden Reaktionspartner auf der Metalloberfläche immobilisiert und mit dem zweiten, gelösten Reaktionspartner über das angrenzende Dielektrikum in Kontakt gebracht.
Immobilisierungsstrategien
Viele Biosensoren und -assays basieren auf der Anbindung der Fängermoleküle an feste Oberflächen [8]. Aufgrund der Immobilisierung und der damit einhergehenden räumlichen Hinderung durch die feste Oberfläche sowie wegen der zufälligen Orientierung der Biomoleküle verringert sich häufig ein Teil der Bindungsaktivität der Fängermoleküle [8,9]. Um eine möglichst hohe Sensitivität des jeweiligen Sensors zu gewährleisten, ist es erforderlich, eine geeignete Immobilisierungsstrategie auszuwählen [8]. Vor allem für Messungen in Realproben ist es entscheidend, dass die funktionalisierte Fläche eine ausreichend hohe Immobilisierungsdichte und eine genügend hohe Bindungsaktivität besitzt, um auch Analyten in geringen Konzentrationen detektieren zu können [10]. Eine weitere wichtige Voraussetzung für die Entwicklung eines sensitiven Biosensors ist das Blocken freier Bereiche der Sensoroberfläche, um unspezifischer Bindungen der verschiedenen Probenbestandteile zu vermeiden. Zusätzlich sollte stets eine Referenzfläche parallel untersucht werden. So können, der Anteil an unspezifischer Bindung sowie Puffereffekte abgeschätzt werden [10]. Folglich muss die Referenzfläche so identisch wie möglich zur Messfläche sein. Im Idealfall werden demzufolge auf der Referenzfläche Moleküle ohne Affinität zu dem entsprechenden Antigen oder den anderen Serumbestandteilen auf die gleiche Weise wie die sensitiven Fängermoleküle immobilisiert [10].
In vielen Biosensoren sind die Sensorchips regenerierbar und ermöglichen damit mehrere reproduzierbare Bindungszyklen [2,11]. Dazu wird eine geeignete Lösung injiziert, welche im Idealfall die Analyten von den Fängermolekülen entfernt, ohne letztere zu zerstören.
Die Biomoleküle können generell über Physisorption, Fc-bindende Proteine, Crosslinker, kovalente Bindungen, Self-assembled Monolayers (SAM) oder eingebettet in Matrices auf die Goldoberfläche eines SPR-Chips immobilisiert werden [9,11,12].
Die Physisorption ist eine der einfachsten Methoden, mit der eine große Menge an Biomolekülen auf eine Oberfläche aufgebracht werden kann [11]. Allerdings besteht die Gefahr, dass die Sekundärstruktur der Proteine durch den direkten Kontakt zur Goldfläche gestört wird [13,14].
Eine Orientierung von Antikörpern ist über die Immobilisierung mittels Fc-bindenden Proteinen, wie Protein A oder G, möglich [9,14,15]. Protein A ist ein ca. 64 kDa großes Zellwandprotein von Staphylococcus aureus, das vier Bindungsstellen für den Fc-Bereich von Immunoglobulinen vieler Wirbeltiere besitzt, im Gegensatz zu Protein G mit zwei Bindungsstellen [9,15]. Zudem bildet es einen Spacer zwischen den Antikörpern und der Goldfläche aus. Darüber hinaus besitzt Protein A eine weitere wichtige Eigenschaft, die vor allem bei der Aufreinigung von Antikörpern genutzt wird. Es ist die Regenerierbarkeit bei niedrigen pH-Werten [15].
Crosslinker, wie beispielsweise 3,3-Dithiobis(sulfosuccinimidylpropionat) (DTSSP), können in Kombination mit Fc-bindenden Proteinen oder als Monolayer verwendet werden [16,17]. DTSSP besteht aus einer Kette mit acht Kohlenstoffatomen, an dessen Enden sich jeweils ein N-Hydroxysulfosuccinimid-Ester befindet. Dort können sich primäre Amine kovalent anbinden [18]. Die Bindung an Gold wird über die im Spacer-Arm enthaltene Disulfidbrücke realisiert. Bei der Verwendung von DTSSP-Monolayern steht dem Vorteil der kovalenten Anbindung der Biomoleküle ihre zufällige Orientierung gegenüber, da Proteine meist mehrere primäre Amine enthalten.
Eine gerichtete Immobilisierung der Biomoleküle kann erreicht werden, indem zunächst Protein A auf die DTSSP-Schicht gegeben wird und anschließend die Immobilisierung der Antikörper erfolgt [16]. Zudem verhindert diese Immobilisierungsvariante eine mögliche Denaturierung des Protein A durch den direkten Kontakt mit der Goldoberfläche [13].
SAMs eignen sich besonders, um den Kontakt der Liganden mit der Goldfläche und die unspezifische Anbindung von Probenbestandteilen zu minimieren [2]. Zudem weisen SAM-basierte Proteinchips häufig eine hohe Stabilität in extremen pH- und Temperaturbereichen auf [8]. Über eine endständige Funktionalisierung können die Biomoleküle stabil an die Monolayer angebunden werden [8].
Eine Möglichkeit für eine endständige Ankopplungsstelle bildet die Biotin-Streptavidin-Bindung, da sie sich schnell ausbildet und in weiten pH- und Temperaturbereichen stabil ist [10,14,19,20]. Die Biotin-Streptavidin-Bindung ist eine der stärksten nicht-kovalenten biologischen Bindungen (Dissoziationskonstante 4∙10-14 mol/L) [20]. Die Grundlage der Monolayer bilden häufig Alkanthiole oder Polyethylenglykole (PEG) [2,8,10–14,19,21,22]. PEG ist ein Polymer, das für seine proteinabweisenden Eigenschaften bekannt ist und sich daher besonders als Bestandteil der Funktionalisierung von Proteinchips, auf denen Realproben vermessen werden, eignet [10,19,21,23].
Das wohl bekannteste Beispiel für Matrices auf SPR-Sensorchips ist die carboxymethylierte Dextran-Schicht, die auf den etablierten SPR-Chips von Biacore verwendet werden [8,24]. Ähnlich wie PEG bildet Dextran eine hydrophile Schutzschicht zwischen dem Gold und den Biomolekülen und verhindert so unspezifische Anbindungen über hydrophobe Wechselwirkungen sowie den direkten, meist denaturierenden, Kontakt der Erkennungsstruktur mit der Goldoberfläche [24]. Über die 3D-Struktur des Dextrans kann eine höhere Immobilisierungsdichte als bei eindimensionalen Funktionalisierungen erreicht werden. Die Immobilisierung der Antikörper erfolgt meist kovalent über Thiol-, Aldehyd-, Amin- oder Carboxylgruppen und ist somit ungerichtet [8].
Das liSPR-System
Am Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik TU Dresden steht das liSPR-System (capitalis technology GmbH, Berlin, Deutschland) zur Verfügung [25]. Es stellt ein miniaturisiertes System dar, welches das simultane Charakterisieren einer Probe mit zahlreichen Bindungspartnern ermöglicht [25–27] und besteht aus einem Spektrometer mit dazugehöriger Software, einem Probenhandlingsystem sowie einem lab-on-a-chip System, zusammengesetzt aus einer temperierbaren On-Chip-Mikrofluidik und den entsprechenden Sensorchips (Abb. 1).
Abb. 4 Sensorgramm der Thrombin-Konzentrationsreihe (von unten nach oben: 0 nmol/L, 26,25 nmol/L, 39,37 nmol/L, 52,5 nmol/L, 78,75 nmol/L, 105 nmol/L, 157,5 nmol/L, 210 nmol/L, 315 nmol/L und 420 nmol/L) auf mit Anti-Thrombin Aptamer funktionalisierten Flächen. Die Signale des Referenz-Aptamers wurden von den Bindungssignalen abgezogen [28].
Zur Abschätzung der Spezifität der detektierten Signale ist ein Referenzkanal unabdingbar. Ein Referenz-Aptamer, das keine Affinität zu dem entsprechenden Antigen oder den Serumbestandteilen besitzt, wurde auf die gleiche Weise wie das Anti-Thrombin Aptamer immobilisiert.
Zur Ermittlung einer Nachweisgrenze und Erstellung der Kalibrierungskurven wurden Thrombin-Konzentrationen von 0 nmol/L bis 420 nm online auf zuvor nach dem erarbeiteten Immobilisierungsprotokoll funktionalisierten Chips injiziert (Abb. 4). Die Aptamer-Flächen wurden nach jeder Bindung mit einem 1 mol/L NaCl regeneriert.
Die ermittelte Nachweisgrenze liegt bei einer Thrombin-Konzentration von 26 nmol/L [28].
Zusammenfassung und Ausblick
Die SPR-Spektroskopie gehört zu den bevorzugt eingesetzten Detektionsmethoden in der Biosensorik, da sie Veränderungen des Brechungsindexes, hervorgerufen durch die Bildung des Immunkomplexes, ohne zusätzliche Modifizierung der Reaktionspartner erfassen kann.
Eine der größten Herausforderungen ist dabei die Auswahl geeigneter Strategien zur Immobilisierung der jeweiligen Fängermoleküle an die Sensorfläche als Voraussetzung für die nachfolgende, spezifische Bindung des nachzuweisenden Analyten. In diesem Kontext werden am Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik verschiedene Möglichkeiten zur Oberflächenmodifikationen (von 2D bis 3D) für die kontinuierliche SPR-basierte Überwachung von Fermentations- und Kultivierungsprozessen erarbeitet und untersucht.
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