Wahl des geeigneten Detergens zur Analyse der Quartärstruktur eines Membranproteins

Einleitung:

Membranproteine gehören zu den Schlüsselbausteinen lebender Zellen. In ihrem natürlichen Umfeld sind sie Bestandteil der doppellagigen Zellmembran und können so eine Mittlerrolle zwischen „außen“ und „innen“ übernehmen. Dadurch erfüllen sie lebenswichtige Aufgaben und sind zudem Angriffspunkte für eine große Zahl von Medikamenten, so etwa Transportinhibitoren oder Rezeptorantagonisten. Will man diese Proteine charakterisieren, müssen sie zunächst schonend isoliert werden mit dem Ziel, sie möglichst in ihrem nativen Zustand in Lösung zu bringen. Um dies zu erreichen, bedient man sich normalerweise so genannter Detergenzien. Das sind amphiphile Reagenzien, also Moleküle, die einen hydrophoben und einen hydrophilen Anteil besitzen und dadurch in die Membran eindringen können. Sie werden während der Isolierung in geringen Mengen zugesetzt und bilden mit den Eiweißen Komplexe (protein detergent complexes, pdc), wodurch deren ursprüngliche Struktur erhalten bleiben und hernach untersucht werden kann.

Wir stellen hier eine Methode zur Bestimmung der Quartärstruktur von Membranproteinen und zur Kontrolle des Erhalts des nativen Oligomerisierungszustandes waehrend der Proteinisolation.

Die klassische Form der Größen-Ausschluss-Chromatographie (GPC/SEC) eignet sich kaum für die quantiative Untersuchung von Protein-Detergens-Komplexen, aufgrund des Fehlens geiegneter Standards. In diesem Dilemma kommt dem analytischen Chemiker eine Methodik zu Hilfe, die eine absolute Charakterisierung von Makromolekülen erlaubt, und zwar ohne jeglichen Standard, andere Bezugsgrößen oder a priori gemachte Annahmen über die Moleküle. Dabei handelt es sich um die Lichtstreuungsmessung. Die Kombination von chromatographischen Separationstechniken mit der Lichtstreuung stellt ein leistungsfähiges Verfahren dar, mit dem man Makromoleküle umfassend charakterisieren kann. Dazu gehören Eigenschaften wie Poly- oder Monodispersität der Probe, Oligomerisierungsstatus, Wechselwirkungen zwischen Proteinen oder auch die Komplexbildung mit andersartigen Molekülen.

Als Beispiel zeigen wir im Folgenden die Untersuchung der Quartärstruktur von CorA, einem Ion-Transportprotein, das aus einem  Bakterium, Methanosarcina mazei, isoliert wurde.

In früheren kristallographischen Untersuchungen wurde gezeigt, dass dieses Eiweiß aus fünf Untereinheiten besteht, also ein Homopentamer bildet. CorA eignet sich aufgrund seiner komplexen Nativstruktur gut dazu, den Einfluss unterschiedlicher Detergenzien auf den Isolierungsprozess zu untersuchen. Daher kamen bei der Analyse zwei solche Verbindungen zum Einsatz.

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Die Proteinproben werden zunächst mittels einer analytischen Säule an einem Alliance 2695 HPLC-System aufgetrennt. Danach werden sie in einen Photo-Dioden-Array vom Typ Waters 2996 geleitet, wo ihre optische Dichte gemessen wird.

Methodik:

Folgende Methoden wurden benutzt: UV-Spektrophotometrie (UV), Mehrwinkel-Lichtstreuung (MALS) kombiniert mit Refraktometrie und on-line gekoppelt mit analytischer Größen-Ausschlusschromatographie (GPC/SEC). Zum Einsatz kamen ein Photo Diode Array 2996 (Waters), ein MiniDawn Treos (Wyatt Technology) sowie ein Optilab rEX (Wyatt Technology). Die Chromatographiesäule war eine 15 mL KW-804 (Shodex) an einem Alliance HPLC 2695 - System (Waters). Zum instrumentellen Aufbau siehe Abbildung 1.

Das Laufmittel enthielt: 10 mM Tris (pH 8.0), 300 mM NaCl sowie  5% (v/v) Glycerin.

Als Detergenzien wurden benutzt:

1. 0.05% n-Dodecyl-ß-D-maltopyranosid (DDM)
oder
2. 0.1% Lauryl-dimethyl-N-amin-oxid (LDAO)

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Im Anschluss gelangen die Proben in ein Drei-Winkel-Lichtstreu-Messgerät vom Typ Mini Dawn Treos (Wyatt Technology) und dann zu einem Refraktometer (Wyatt Optilab rEX). Die Bestimmung des hydrodynamischen Radius der Proben erfolgt ebenfalls online, und zwar mit einem DLS-Instrument vom Typ DynaPro (Wyatt Technology).

Zur Datenauswertung wurde der Zimm-Formalismus benutzt:

K^*c / R(θ,c) = 1 / MwP(θ) + 2A₂c     (1)

Dabei gilt:

R(θ,c):  die erhöhte Rayleigh-Ratio der Lösung als Funktion aus dem Streuwinkel θ und der Konzentration c

Mw: die gewichtsgemittelte Molmasse

A₂ : der zweite Virialkoeffizient

P(θ): beschreibt die Winkelabhängigkeit des Streulichts und steht in Beziehung zum Gyrationsradius (auch RMS-Radius genannt)

K^{* :} Konstante aus 4π²(dn/dc)²n₀²/Naλ₀⁴, mit Na = Avogadro-Zahl, dn/dc = Inkrement des refraktiven Index mit der molekularen Konzentration, n₀ =  refraktiver Index des Lösemittels und λ₀ = Wellenlänge des einfallenden Lichtes

Für Biopolymere, also auch für Proteine, ist der Wert für P(θ) ≈ 1. C kann online gemessen werden (UV oder Refraktometrie)

Bei verdünnten Lösungen, wie sie im Falle der GPC/SEC vorliegen, kann A₂ vernachlässigt werden. Der Wert für dn/dc ist konstant und liegt für das Protein zwischen 0,180 und 0,185 mL.g^-1. Zur Bestimmung von dn/dc für die Detergenzien bzw. den Protein-Detergens-Komplex siehe Veesler et al. (1).

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Charakterisierung des Proteins CorA aus Methanosarcina mazei mithilfe von SEC/MALS/UV/Refraktometrie, isoliert und aufgereinigt in DDM auf einer 15 mL-Säule vom Typ Shodex KW-804. Die linke Y-Achse zeigt die UV-Absorption bei 280 nm Wellenlänge. Die farbig aufgetragenen Spuren stehen für die gemessenen Molmassen entlang den chromatographischen Peaks, welche auf der rechten Y-Achse abzulesen sind. Die Gesamtmasse des Protein-Detergens-Komplexes (rot) setzt sich zusammen aus der Proteinmasse (grün) und dem daran assoziierten Detergens (blau).

Ergebnisse:

In Abbildung 2 sind die UV-Signale bei 280 nm dargestellt, die von den aufgereinigten Präparationen des Proteins CorA aufgezeichnet wurden. Sie zeigen, dass CorA mit dem Detergens DDM etwas früher eluiert als mit LDAO isoliertes. Zudem besitzt das letztere ein schärferes und stärker symmetrisches Elutionsprofil. Die aus GPC/SEC, MALS, Refraktometrie und UV-Absorption kombinierte Detektion ermöglichte die Messung der Molmassen des Protein-Detergens-Komplexes sowie darüber hinaus der Protein- und der Detergensfraktionen. Für CorA in DDM wurde eine Masse von 355 kDa ermittelt, für die Proteinfraktion alleine 241 kDa und den Detergensanteil 114 kDa (Abbildung 2 A). Diese Daten passen sehr gut zu den Massen, mit denen man aufgrund theoretischer Annahmen für das Protein in seiner physiologisch aktiven Quartärstruktur, also dem Pentamer, rechnen konnte, nämlich 5 x 46.9 kDa = 234.5 kDa (vs gemessene 241 kDa).

In scharfem Kontrast zu diesen Befunden stehen die Molmassen, welche sich für die mit LDAO isolierten CorA-Proteine ergaben:

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Charakterisierung des Proteins CorA aus Methanosarcina mazei mithilfe von SEC/MALS/UV/Refraktometrie, isoliert und aufgereinigt in LDAO auf einer 15 mL-Säule vom Typ Shodex KW-804. Die linke Y-Achse zeigt die UV-Absorption bei 280 nm Wellenlänge. Die farbig aufgetragenen Spuren stehen für die gemessenen Molmassen entlang den chromatographischen Peaks, welche auf der rechten Y-Achse abzulesen sind. Die Gesamtmasse des Protein-Detergens-Komplexes (rot) setzt sich zusammen aus der Proteinmasse (grün) und dem daran assoziierten Detergens (blau).

Die Molmasse des Protein-Detergens-Komplexes lag in diesem Falle bei 93 kDa und entsprach damit der Summe aus den Einzelkomponenten von Protein (47 kDa) und Detergens (46 kDa). Daraus kann man schließen, dass die Verwendung von LDAO bei der Isolierung von CorA zur vollständigen Dissoziation des Pentamers in seine Einzelkomponenten (Monomere) führt (Abbildung 2 B). Dabei wird zwangsläufig die native Struktur des Membranproteins zerstört.

Im Licht dieser Befunde erscheint DDM als Detergens der Wahl für die schonende Isolierung von CorA in seiner funktionalen Form.

Zusammenfassung:

Die hier gezeigten Untersuchungen machen deutlich, dass MALS, kombiniert mit Refraktometrie und UV-Absorption, ein leistungsfähiges methodisches Werkzeug darstellt, wenn man Membranproteine mit Hilfe von Detergenzien isolieren und charakterisieren will. Man kann damit zuverlässig Molmassenbestimmungen ohne Säulenkalibrierung durchführen. Generell ist die klassische Kalibrierung mit löslichen Proteinstandards nicht sinnvoll, wenn man es mit Komplexen aus Protein und Detergens zu tun hat aufgrund des Effekts des letzteren auf die hydrodynamischen Eigenschaften des Gesamtkomplexes.

Dieser experimentelle Ansatz liefert Aufschluss über den Zustand des isolierten Proteins und kann dem Anwender zusätzliche aufwändige Untersuchungen von Struktur und Funktionsfähigkeit des Isolats ersparen.

Zudem trägt diese Technik der makromolekularen Charakterisierung wesentlich zum Gelingen von Kristallisationsexperimenten oder biochemischen Studien bei, in denen es entscheidend auf die Erhaltung der Proteinaktivität und die Reinheit der Präparation ankommt.

Literatur:

1. David Veesler, Stéphanie Blangy, Marina Siponen, Renaud Vincentelli, Christian Cambillau, Giuliano Sciara: Production and biophysical characterization of the CorA transporter from Methanosarcina mazei Analytical Biochemistry 388: 115–121, 2009