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Lumineszenz-basierter Assay für Proteasom-Aktivität in Gewebeextrakten

Einleitung

Das Ubiquitin-Proteasom System (UPS) kennzeichnet Proteine, die degradiert werden sollen. Es ist daher wichtig für den Abbau fälschlich-produzierter und fehlgefalteter Proteine und es reguliert die Halbwertszeit und Aktivität der Proteine in der Zelle. Das UPS wird mit dem Zellzyklus (1) und der Suppression der HPV-Onkogenese beim Gebärmutterhalskrebs (2) in Verbindung gebracht. Es wird angenommen, dass der Verlust der Proteasom-Funktion eine Rolle in Krankheitsbildern wie neurodegenarativen Erkrankungen (3), Diabetes (4) und Myofibrillärer Mypopathien (5) spielt.

Da Gewebeproben aus Biopsien meist nur in geringen Mengen verfügbar sind, ist es schwierig Proteasom-assoziierte Krankheiten zu erforschen. In einem Artikel von Strucksberg et al., veröffentlicht in Analytical Biochemistry (6), entwickelten die Autoren ein hoch sensitiven Proteasom-Aktivitäts-Assay für geringe Mengen von Skelettmuskeln. Biolumineszente Proteasom-Assays wurden bereits für die Aufreinigung von Proteasom (7, Proteasome-Glo™ Assays) und für Zellen in Kultur (8, Proteasome-Glo™ Cell-Based Assays) entwickelt, dieser Artikel beschreibt eine Anwendung der Proteasome-Glo™ Assays für Gewebe-Extrakte. Die Anwendung dieses sensitiven und verlässlichen Assays auf Gewebe-Extrakte könnte eine eingehende Untersuchung der Mechanismen von Proteasom-vermittelte Pathologien ermöglichen.

Gewebe-Aufbereitung

Die Autoren nutzen für die Entwicklung ihres Assays Quadriceps Femoris und Soleus Muskeln aus Maus. Sie fanden heraus, dass die Vorbereitung der Gewebeproben kritisch ist für verlässliche Assay Resultate. Gewebe wurde durch Ultraschall aufgeschlossen und Lysate mit eiskalten Reagenzien vorbereitet und kalt zentrifugiert. Der Proteingehalt wurde mit einem fluoreszenten Quantifizierungskit gemessen. Nach der Quantifizierung wurden 3 µg des Proteinextrakt Überstands via Western Blot analysiert und die Menge an 26S S4-Untereinheit in jedem Gewebeextrakt bestimmt, um die Aktivitätsassays hinterher normalisieren zu können.

Abbildung 1: Die Proteasom-Aktiviät schneidet ein luminogenes Substrat. Durch den Schnitt wird Aminoluciferin in Luciferin umgesetzt. Die Luciferase setzt dieses wiederum in ein Lichtsignal um, das proportional zur Proteasom-Aktivität ist.

Assay-Protokoll

Für den Proteasom Aktivtätsassay modifizierten die Autoren den Proteoasome-Glo™ Chymotrypsin-Like Assay und den Proteasome-Glo™ Trypsin-Like Assay. Diese beiden Assays überwachen zwei der drei katalytischen Aktivitäten des Proteasoms. Sie wurden ursprünglich eher entwickelt, um etwa Wirkstoffe auf ihren Effekt auf die Proteasom-Aktivität zu screenen als für die Charakterisierung der Proteasom-Aktivität von Gewebe-Extrakten. Die Enzym-gekoppelten lumineszenten Assays benötigen nur die einmalige Zugabe des Reagenzienmix. Die Proteasom-Aktivität schneidet ein luminogenes Substrat. Dieses enthält ein spezifisches Signalpeptid gekoppelt mit Aminoluciferin. Durch den Schnitt wird das Aminoluciferin zur Luciferin umgesetzt. Das wiederum in einer zweiten simultanen Reaktion als Substrat für die Luciferase dient, die Licht generiert. Diese Enzym-gekoppelte Reaktion produziert ein stabiles lumineszentes Signal, das proportional zu der Proteasom-Aktivität in der Probe ist. (Abbildung 1)

Um die Assays an die Gewebe-Extrakte anzupassen, veränderten die Autoren das Protokoll folgendermaßen:

  1. Die Extrakte wurden wie im Paper beschrieben vorbereitet und 3µg des Extrakt-Überstandes wurden mit Western Blots analysiert, um die 25S Proteasom S4-Untereinheit zu quantifizieren.
  2. Die Proteinextrakte wurden in eiskalten PBSE auf 0.2 mg/ml verdünnt.
  3. Eine Gesamtmenge von 10µg Protein (50 µl der verdünnten Extrakte) wurden zu 50 µl der Assay-Reagenz in eine 96-well-Platte gegeben. Die Assay-Reagenz enthält Ultra-Glo™ Luciferase und das spezifische luminogene Substrat (Suc-LLVY-Glo™ für den Proteasome-Glo™ Chymotrypsin-like Cell-Based Assay beziehungsweise Z-LRR-Glo™ für den Tyrpsin-like Assay).
  4. Die Bestandteile wurden vermischt und für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
  5. Das lumineszente Signal wurde dreimal gemessen, mit einer Integrationszeit von 1 Sekunde auf einem Fluoroskan Ascent FL Plattenlesegerät mit einem Photomultiplier-Zähler im luminometrischen Modus.

Die Intensität des luminometrischen Signals zeigt die Aktivität der gesamten Peptidase-Aktivität im Extrakt: die des Proteasoms sowie jeder nicht-spezifischen Peptidase, die das Peptid vom Aminoluciferin abschneidet. Um die Proteasom-Aktivität zu berechnen, wurden zwei Messungen durchgeführt: eine mit der Zugabe eines irreversiblen und spezfischen Proteasom-Inhibitors, Adamantan-Acetyl-(6-Aminohexanoyl)3-(Leucinyl)3-Vinyl-(Methyl)-Sulfon, und eine Messung ohne Inhibitor. Die Proteasom-Aktivität wurde berechnet, indem die Werte aus dem Assay mit Inhibitor (Hintergrund) von der Gesamtaktivität (kein Inhibitor) abgezogen wurde. Die proteasomale Aktivität der verschiedenen Extrakte wurde anhand der Proteasom-Menge in den Extrakten, normalisiert.

Überlegungen und Ergebnisse

Verschiedene Faktoren waren für die Erreichung eines sensitiven und zuverlässigen Assays kritisch. Wie die Autoren feststellten, reduziert ein einziger Einfrierzyklus der Extrakte bei -80°C die proteosomale Aktivität dramatisch. Außerdem beeinflusste die Menge an Extrakt die Signalintensität und musste für das experimentale System optimiert werden. Die Analyse von mindestens zwei Mäusen war notwendig, um verlässliche Ergebnisse mit akzeptablen Standardabweichungen zu erhalten.

Abbildung 2: Das GloMax®-Multi+ Detection System ist optimal auf die Assays von Promega abgestimmt.

Die Proteasome-Glo™ Cell-Based Assays wurden entwickelt, um die Abgabe von lysosomalen Protein, das unspezifisches Hintergrundsignal produzieren kann, einzuschränken. Dennoch ist es schwierig in Gewebe Extrakten lysosomale Proteasen zu vermeiden, speziell, wenn die Proben mit Ultraschall aufgeschlossen werden. Die Autoren nutzten einen Proteasom-spezifischen Inhibitor, um die Spezifität des Signals zu gewährleisten. Die Bestimmung der unspezifischen Aktivität und die Normalisierung auf die Gesamtmenge des Proteasoms in den Extrakten waren essenziell, um die Assays für die Anwendung mit Gewebe abzuwandeln. Sobald der Assay für den Skelettmuskel aus Maus optimiert war, zeigten die Autoren, dass die Proteasom-Aktivität sich in verschiedenen Muskeln des gleichen „normalen“ Tieres unterscheidet. Sie zeigten außerdem, dass die Proteasom-Aktivität mit dem Alter abnimmt.

Literatur

  1. Cui, C. et al. (2010). Degradation of the human mitotic checkpoint kinase Mps1 is cell-cycle rgulated by cdc20 and APC/ cCdh1 ubiquitin ligases. J. Biol. Chem. Epub Aug 20.
  2. Alam, S. et al. (2006) Adeno-Associated Virus Type 2 increases proteasome-dependent degradation of p21WAF1 in a Human Papillomavirus Type31b-positive cervical carcinoma line. J. Virol. 80, 4927–39.
  3. Branco, D.M. et al. (2010) Crosstalk between mitochondria and proteasome in Parkinson disease pathogenesis. Frontiers in Aging, Neuroscience. 2, 17.
  4. Hu, J. et al. (2008) Cardiac muscle protein catabolism in diabetes mellitus: activation of the ubiquitin-proteasome system by insulin deficiency. Endocrinology. 149, 5384–90.
  5. Schröder, R. and Schoser, B. (2009) Myofibrillar myopathies: a clinical and myopathological guide. Brain Pathol. 19, 483–92.
  6. Strucksberg, K-H. et al.(2010) Proteasomal activity in skeletal muscle: a matter of assay design, muscle type, and age. Anal. Biochem. 399, 225–9.
  7. O'Brien, M.A. et al. (2008) Homogeneous, bioluminescent proteasome assays. In: Apoptosis and Cancer: Methods and Protocols. Humana Press. Mor, G. and Alvero, A., eds. Methods in Molecular Biology Series. 414, 163–81.
  8. Moravec, R.A. et al. (2009) Cell-based bioluminescent assays for all three proteasome activities in a homogeneous format. Anal. Biochem. 387, 294–302.

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