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Dem Zucker auf den Zahn gefühlt

Einsatz neuartiger Analysenmethoden

Die Erfahrungen mit dem Zucker beginnen bereits im frühen Kindesalter – schon in der Muttermilch befindet sich Milchzucker. Die menschliche Sensorik allein reicht jedoch nicht aus, um die nützlichen, aber auch potentiell schädlichen Wirkungen eines jahrtausendealten Süßungsmittels (Saccharose) richtig einzuschätzen. Deshalb haben Ernährungsforscher und Mediziner die Verbindungsklasse der Zucker, dabei besonders die Glucose, seit längerer Zeit im Blick.

Entscheidende Fortschritte auf dem Gebiet der Stoffwechselforschung des Zuckers konnten aber erst durch die Verfügbarkeit neuer Analysenmethoden erzielt werden. Shimadzu hat dabei unter anderem mit GC-MS (Gas-Chromatographie-Massenspektrometer)-Systemen Möglichkeiten eröffnet, den Glucosestoffwechsel bei Mensch und Tier detailliert und präzise zu messen. Eine über Jahrzehnte gewachsene analytische Kompetenz bildet dafür die Grundlage.

Man weiß bereits sehr viel über die Glucose, die u. a. Bestandteil des im Haushalt verwendeten Zuckers ist. Der tägliche Glucosebedarf eines erwachsenen Menschen liegt bei rund 180 g, wovon allein das Gehirn als größter Konsument 80% dieser Menge für energetische Zwecke benötigt. Das ist der Grund dafür, dass bei kurzfristigen Hungerperioden die Glucose neu synthetisiert werden muss. Diesen Vorgang bezeichnet man als Gluconeogenese. Sie findet in der Leber, in der Nierenrinde und auch im Darm statt. Als Substrate werden Pyruvat, Lactat, Glycerol, Alanin und Propionat (bei Wiederkäuern) verwendet. Überschüssige Glucose wird in Form von Glycogen im Körper gespeichert und bei Bedarf, zum Beispiel bei körperlicher Aktivität, wieder in Glucose überführt.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Glucosestoffwechsels

Die Konzentration der Glucose im Blut des erwachsenen Menschen (normal: 90 – 110 mg/100 ml) spiegelt einen Teil des Glucosestatus wieder. Er kann inzwischen mit preiswerten Geräten schnell und sicher vom Patienten selbst gemessen werden. Es bleibt dabei aber ungeklärt, wie ein erhöhter oder erniedrigter Blutglucosewert zustande kommt. Das heißt es ist unbekannt, wie schnell die Glucose im Körper neu gebildet und wie schnell sie für die Energiegewinnung und zur Bildung anderer Verbindungen wieder verbraucht wird. Aufklärung über diese Prozesse ist möglich, wenn spezielle Markierungstechniken verwendet werden. Die dafür erforderlichen chemischen Sonden heißen Tracer.

Um die Stoffwechseldynamik der Glucose (also ihren Auf- und Abbau) zu verfolgen, ist es zweckmäßig, eine markierte („etikettierte“) Glucose in den Körperstoffwechsel einzuschleusen. Wie kann aber ein derartiger Glucose-Tracer hergestellt werden? Die Natur bietet für die in der Glucose enthaltenen Elemente Wasserstoff, Kohlenstoff und Sauerstoff (Summenformel: C6H12O6) unterschiedlich schwere Elementarten, sog. Isotope an, die sich für eine „Etikettierung“ eignen. Für den Wasserstoff gibt es die stabilen, nichtradioaktiven (!) Isotope Protium mit der Masse 1 (Symbol: 1H) und Deuterium mit der Masse 2 (Symbol: 2H oder kürzer D). Beim Kohlenstoff sind es die stabilen Isotope 12C und 13C.

Das natürliche Vorkommen der schweren stabilen Isotope ist im konkreten Fall sehr gering, das heißt von 1.000 Glucosemolekülen gibt es nur ca. ein Molekül mit einem Deuterium an einem der sechs Kohlenstoffatome. Durch Trinken einer kleinen Menge von schwerem Wasser (D2O) kann der Deuteriumanteil im Glucosemolekül gegenüber dem natürlichen Anteil erhöht („angereichert“) und damit eine „markierte“ Glucose erzeugt werden, die sich von der „normalen“ Glucose unterscheidet. Im Folgenden soll anhand der sog. D2O („Schwerwasser“)-Methode skizziert werden, wie aus der Deuteriumanreicherung in der Glucose die Gluconeogenese (in g Glucose/Tag) bestimmt werden kann.

Die D2O („Schwerwasser“)-Methode

Die D2O-Methode beruht darauf, dass nach oraler Aufnahme von D2O (0,6 g pro kg Körpergewicht) mit einem D-Anteil von > 50% zunächst eine rasche Verteilung im Körperwasser-Pool (entspricht ca. 60% des Körpergewichts) stattfindet. Danach trägt ca. 1% der Wassermoleküle ein Deuteriumatom. Infolge enzymatischer Reaktionen erfolgt anschließend der Einbau von Deuteriumatomen des Wassers in die Glucose. Dabei geben die Unterschiede des Deuteriumgehalts an dem Kohlenstoffatom C2 und den anderen C-Atomen Hinweise auf spezifische Stoffwechselwege. Der Deuteriumgehalt in den verschiedenen Molekülpositionen kann an dem Aldonitrilpentaacetat-Derivat der Blutglucose mittels GC-MS gemessen werden.

Die D-Anreicherung am C2, E(C2), ist proportional zu der im Körper produzierten Glucose (GP), das heißt der Summe aus neu synthetisierter und durch Abbau von Glycogen freigesetzter „alter“ Glucose. Die D-Anreicherung am Kohlenstoff C5, E(C5), ist ein Indikator für die neu synthetisierte Glucose. Durch enzymatische Austauschreaktionen ist die D-Anreicherung an den anderen Kohlenstoffatomen (außer C2) ähnlich hoch. Somit können die relative Gluconeogenese GNGrel (in % der Glucoseproduktion GP) und die absolute GNGabs folgendermaßen berechnet werden:

Die Glucoseproduktion GP wird in einer separaten Untersuchung zum Beispiel mit einer deuterierten Glucose bestimmt, die am Kohlenstoffatom C6 zwei D-Atome besitzt. Der Faktor 3 in Gl. (1) resultiert daraus, dass insgesamt 3 H- bzw. D-Atome an den Kohlenstoffatomen C5 und C6 der Glucose gebunden sind (siehe Abbildung 2).

Abbildung 2: Fragmentierungen von Glucose-Aldonitrilpentaacetat

Die D-Anreicherungen E(C5)+E(C6) und E(C2) lassen sich mittels GC-MS bei relativ geringem analytischen Aufwand aus den Massefragmenten m/z 145 (C5-C6), 187 (C3-C6) und 328 (C1-C6) der derivatisierten Glucose bestimmen (Junghans et al., 2010). Die für die Berechnung notwendigen Peakintensitäten der Massefragmente mit ihren sog. Isotopomeren M+1, M+2 und M+3 (Einbau von 1, 2 oder 3 Deuteriumatomen pro Glucosemolekül) können aus dem EI- und PCI-Spektrum der Aldonitrilpentaacetat-Glucose gewonnen werden (Abbildung 3). Die Interferenz des Fragments m/z 145 mit einem anderen Fragment wird durch Verwendung eines weiteren Glucosederivats umgangen.

Abbildung 3a: EI-GC-MS-Spektren des Aldonitrilpentaacetat-Derivates (AAc) der Glucose

Abbildung 3b: PCI-GC-MS-Spektren des Aldonitrilpentaacetat-Derivates (AAc) der Glucose

D2O-Methode unbedenklich für Gesundheit und Umwelt

Beim Einsatz der D2O-Methode ergibt sich die Frage: Stellt das eingesetzte Deuteriumisotop eine Gefahr für den Menschen oder das Tier dar?

Die Antwort ist eindeutig: Nein! Dafür gibt es zwei Gründe:

  1. 1. Die chemischen Eigenschaften der Glucose und demzufolge der Glucose- sowie der angrenzende Stoffwechsel werden durch die Deuteriummarkierung nicht verändert, weil nur ca. 1 % der Glucosemoleküle markiert werden.
  2. 2. Die Isotope des schweren und leichten Wasserstoffs (D und 1H) sind stabil und nichtradioaktiv; somit sind sie selbst für Kleinstkinder und Schwangere völlig ungefährlich.

Die hier aufgezeigte stabilisotope Markierungstechnik in Verbindung mit einer empfindlichen und präzisen GC-MS-Analytik hat gegenüber den in früheren Jahren verwendeten radioaktiven Markierungstechniken wesentliche Vorteile. Die In-vivo-Gluconeogenese kann bestimmt werden, ohne das Untersuchungsobjekt (Mensch oder Tier) oder die Umwelt zu gefährden. Das Probenmaterial ist in Bezug auf die stabilisotope Markierung unbegrenzt haltbar, da kein radioaktiver Zerfall stattfindet.

Junghans P, Görs S, Lang IS, Steinhoff J, Hammon HM, Metges CC. (2010) A simplified mass isotopomer approach to estimate gluconeogenesis rate in vivo using deuterium oxide. Rapid Commun Mass Spectrom. 24:1287-95.

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