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Charakterisierung von Biotherapeutika

Intelligente HPLC-Lösungen für große Moleküle

Regina Römling, Tosoh Bioscience GmbH, Stuttgart, Deutschland

Die Entwicklung und Herstellung von Biopharmazeutika ist ein stetig wachsendes Segment der pharmazeutischen Industrie. Zu den therapeutischen Proteinen gehören Blutfaktoren, Wachstumsfaktoren, Interferone, Interleukine, therapeutische Enzyme und nicht zuletzt monoklonale Antikörper. Mehr als zwanzig monoklonale Antikörper (mAb)-Therapeutika sind zurzeit zur Behandlung einer breiten Palette von Krankheiten, wie Autoimmunerkrankungen, Herz-Kreislaufsowie Infektionskrankheiten und Krebs, zugelassen. Eine gründliche Charakterisierung therapeutischer Biomoleküle ist ein zentraler Punkt für die erfolgreiche Einreichung von Forschungs- und Produktionsdaten für behördliche Genehmigungen neuer Medikamente. Die Flüssigchromatographie ist aufgrund des hohen Automatisierungsgrades, ihrer Robustheit und Reproduzierbarkeit heute das Arbeitspferd des pharmazeutischen Labors. Daher wird HPLC auch häufig als Methode für die Analyse von Biotherapeutika eingesetzt. Dieser Artikel beschreibt einige der gängigsten HPLC-Anwendungen für die Charakterisierung von Biopharmazeutika.

Die typischen Chromatographiearten zur Trennung von Proteinen in nativer Form wie Größenausschluss- Chromatographie (SEC) und Ionenaustausch- Chromatographie (IEC) werden routinemäßig zur Charakterisierung von Biotherapeutika eingesetzt. Darüber hinaus werden Umkehrphasen- (RPC) und hydrophile Interaktions- (HILIC) Flüssigchromatographie angewendet um Peptide oder Oligosaccharidketten nach enzymatischer Spaltung der Proteine zu analysieren. Die Detektion erfolgt üblicherweise durch UV-, Fluoreszenzoder Lichtstreueung. Zusätzliche Strukturinformationen können durch die Anwendung der massenspektrometrischen Detektion gewonnen werden. Einige der gängigen Modi der Biochromatographie werden in diesem Artikel an Beispielen wichtiger Aspekte der Charakterisierung von Proteinen vorgestellt. Dazu gehören die Analyse von Proteinaggregaten, Isoformen, Modifikationen und der Glykosylierungsmuster.

BESTIMMUNG VON PROTEINAGGREGATEN MIT SEC

Proteinaggregation ist ein verbreitetes Problem, das während der Expression, Reinigung und Formulierung von Protein-Biotherapeutika auftritt. Die Proteinaggregation wird beeinflusst von Temperatur, pH-Wert, Ionenstärke und - konzentration.1 Der Anteil der Aggregate muss charakterisiert und bei der Entwicklung von Protein-Pharmazeutika wie monoklonalen Antikörpern gesteuert werden. Selbst kleine Mengen von Aggregaten können die therapeutische Wirkung des Antikörpers verändern. Die Hochleistungs- Größenausschluss-Flüssigkeitschromatographie auf der Basis von Silikasäulen ist die Standardmethode der Industrie bei der Trennung und Quantifizierung von löslichen Proteinaggregaten. Aggregationsanalyse von therapeutischen Proteinen mithilfe von SEC ist fast immer für die behördliche Zulassung erforderlich. Säulenfreie Techniken wie Sedimentationsgeschwindigkeit, analytische Ultrazentrifugation und Feld-Fluss-Fraktionierung sind als ergänzende Techniken für die Aggregationsanalyse geeignet.2

TSK-GEL-Säulen der SW-Serie basieren auf porösen Kieselgel-Partikeln. Eine spezielle Oberflächenmodifikation unterbindet unerwünschte, nichtspezifische Wechsel-wirkungen mit Proteinen. Sie besitzen ein großes Porenvolumen, das zu einer hohen Auflösung bei der Proteinanalyse führt. TSKgel G3000XLSäulen sind der Industriestandard zur Qualitätskontrolle von monoklonalen Antikörpern. Ist die Probe begrenzt oder die Konzentration der Zielmoleküle sehr gering, kann die TSKgel SuperSW3000 Säule eingesetzt werden, um eine noch höhere Auflösung und Empfindlichkeit zu erzielen. Der Innendurchmesser dieser Säulen wurde von 7,8 mm auf 4,6 mm und die Partikelgröße von 5 μm auf 4 μm reduziert, um in Fällen begrenzter Proben höhere Empfindlichkeit zu bieten. Um den vollen Nutzen aus der hohen Effizienz dieser Säulen zu erreichen ist es jedoch notwendig, ein HPLC-System einzusetzen, das in Hinblick auf das Totvolumen optimiert ist und die Peakverbreiterung nach der Säule minimiert.

Abbildung 1: TSKgel G3000SWXL Säule (5 μm, 7,8 mm ID x 30 cm L), Flussrate: 1 ml/Min.; TSKgel Super SW3000 Säule (4 μm, 4,6 mm ID x 30 cm L); Flussrate 0,35 ml/Min.; Mobile Phase: 0,1 M Phosphat pH 6,8, Injektionsvolumen 5 μl, Detektion: UV @ 280 nm (Mikro-Flusszelle)

BESTIMMUNG VON MAB-AGGREGATEN AUF SILIKA BASIERTEN SEC-SÄULEN

Abbildung 1 vergleicht die Analyse von mAb-Aggregaten auf beiden Säulenarten. Die Trennungen wurden auf einem optimierten HPLC-System mit einer Mikro- Durchflusszellle unter identischen Bedingungen durchgeführt. Aufgrund der unterschiedlichen Innendurchmesser der Säulen müssen die Flussraten allerdings unterschiedlich sein, damit dieselbe lineare Flussgeschwindigkeit herrscht; das führt zu einer Flussrate von 1 ml/Min. für die Säule G3000SWXL mit 7.8 mm Innendurchmesser und 0.35 ml/Min. für die Säule SuperSW3000 mit 4.6 mm Innendurchmesser. Abbildung 1 zeigt, dass die Auflösung von Monomer- und Aggregat-Peaks und die Nachweisempfindlichkeit auf der Säule SuperSW höher liegen.

Abbildung 2: TSKgel CM-STAT Säule (7 μm, 4,6 mm ID x 10 cm L), Mobile Phase: A: 20 mM MES (pH 6;0), B: 20 mM MES + 0;5 M NaCl (pH 6;0),Gradient 10% B BIS 15% B in 15 Minuten, Flussrate: 1 ml/ Min,Detektion: UV @ 280 nm, Injektionsvolumen 20 μl

ANALYSE VON LADUNGSVARIANTEN UND PEGYLIERTEN PROTEINEN MIT IEC

Neben isoelektrischer Fokussierung ist die Kationenaustausch- Chromatographie die Methode der Wahl zur Analyse der Ladungs-Heterogenität von Proteinen. Ladungs-Isoformen von Proteinen resultieren aus Desamidierung von Asparagin- oder Glutaminresten oder aus unvollständiger Entfernung von Lysinresten am C-Terminus.3 Moderne Ionenaustauschsäulen können den Durchsatz bei der Qualitätskontrolle (QC) von Biopharmazeutika steigern. TSK-GEL STAT Ionenaustauschsäulen sind nicht poröse Polymersäulen mit hoher Dichte von funktionellen Gruppen an der Oberfläche: Quartäres Ammonium für Anionenaustausch (Q- und DNA-STAT), Carboxymethyl (CM-STAT) und Sulfopropyl (SP-STAT) für den Kationenaustausch. Partikelgrößen und Dimensionen dieser IEC-Säulen sind entweder für höheren Durchsatz oder größere Effizienz optimiert. Anwendungen für die TSK-GEL STAT Kationenaustauschsäulen umfassen die Trennung von Peptiden und Proteinen, PEGylierten Proteinen und Ladungs-Isomeren von monoklonalen Antikörpern. Eine TSKgel CM-STAT Säule (schwacher Kationenaustauscher, WCX) wurde zur Trennung von Ladungsvarianten diverser monoklonaler Antikörper eingesetzt (Abbildung 2). Die typische Analysezeit von circa vierzig Minuten auf konventionellen, 25 cm langen WCX-Säulen konnte durch den Einsatz einer 10 cm langen CM-STAT-Säule, gefüllt mit 7 μm großen Partikeln, deutlich reduziert werden. Die PEGylierung, der Prozess, bei dem Polyethylenglykol- (PEG) Ketten an Protein- und Peptid-Arzneistoffe gebunden werden, ist eine gängige Praxis zur Verlängerung der Serum- Halbwertzeit und Verbesserung der Pharmakokinetik eines Arzneistoffs.4 Als PEGylierungsstellen dienen in der Regel Lysinreste des Proteins. Es besteht eine wachsende Nachfrage nach chromatographischen Methoden zur Trennung modifizierter Isoformen von Proteinen. Der Grad der PEGylierung kann durch die Analyse der Zunahme des Molekulargewichts mittels Größenausschluss-Chromatograpphie kontrolliert werden, da jede PEG-Gruppe die Größe des Proteins merklich steigert. Da jeder PEG-Rest aber auch Teile des Proteins abschirmt und daher die Oberflächenladung ändert, kann die Ionenaustauschchromatographie ebenfalls zur Analyse von PEGylierten Proteinen eingesetzt werden. SEC trennt das native Protein, mono- und di-PEGylierte Formen, aber wegen der spezifischen Art der wechselwirkungsfreien Trennung benötigt SEC eine gewisse Analysezeit und ist daher für Anwendungen mit hohem Durchsatz nicht gut geeignet. IEC Analysen können hingegen mithilfe kürzerer Säulen und neuester Partikel- Technologie beschleunigt werden, wie oben zu sehen. Darüber hinaus kann IEC Isoformen auflösen, die sich nur in der Position der PEGylierten Lysinreste unterscheiden, da die Oberflächenladung des Proteins je nach Position der Modifikation unterschiedlich beeinflusst wird.5

Abbildung 3 zeigt die Kontrolle einer PEGylierungsreaktion von ß-Lactoglobulin in Intervallen von 5 Minuten auf einer TSKgel SP-STAT Säule (starker Kationenaustauscher, SCX) mit hohem Durchsatz. Um eine schnelle Trennung zu erreichen wurde ein Natriumchlorid-Gradient in Natriumacetatpuffer bei hoher Flussrate von 2 ml/Min. eingesetzt. Eine effiziente Reaktionsüberwachung muss das Fortschreiten der Reaktion in kurzen Intervallen verfolgen.

Daher wurde hier eine Säule für hohen Durchsatz verwendet. Zur genaueren Charakterisierung des Endproduktes kann eine bessere Trennung der verschiedenen Mono- PEG-Isoformenmithilfe einer hochauflösenden SCXSäule (10 cm lang, kleinere Partikel) und eines flacheren Gradientenprofils erzielt werden.

CHARAKTERISIERUNG DER GLYKOLYSIERUNG MIT HILIC

Ein weiterer wichtiger QC-Parameter der mAb-Charakterisierung ist die Analyse der Glykolysierung. Die Glykolysierung von mAbs kann die Immunogenität sowie pharmakokinetische und pharmakodynamische Eigenschaften beeinflussen. Nach der EMEA-Leitlinie zur Entwicklung, Herstellung, Charakterisierung und Spezifikationen monoklonaler Antikörper und verwandter Produkte müssen Glykanstrukturen charakterisiert werden. Besondere Aufmerksamkeit soll dem Grad ihrer Mannosylierung, Galaktolysierung, Fucosylierung und Sialysierung geschenkt werden.

Abbildung 3: TSKgel SP-STAT Säule (10 μm, 3,0 mm ID x 3,5 cm L), Mobile Phase: A: 20 mM Natriumacetat (pH 5,0), B: 1,0 M NaCl in Puffer A (pH 5,0), 2 Minuten Gradient von 0 bis 100% B, Flussrate: 2 ml/ Min, Detektion: UV @ 280 nm

Verschiedene komplementäre Analysetechniken werden routinemäßig zur Charakterisierung, Identifizierung und Quantifizierung der aus Glykoproteinen isolierten Oligosaccharide eingesetzt. Die übliche Methode zur QC-Analyse von Glykanen ist die HILIC-/Normalphasen- Trennung von AB-markierten Glykanen mit nachfolgender Fluoreszenzdetektion. Die Markierung der Glykane mit einem fluoreszierenden Label wie 2-Aminobenzamid (2-AB) ermöglicht es, die Zucker auch im Femtomolbereich zu erfassen. HILIC kann Strukturen mit derselben Zusammensetzung (isobare Glykoformen wie α-2,3- oder α-2,6-Sialinsäure) auf der Grundlage von Sequenz sowie Bindungsart trennen.7,8 Komplementäre Methoden, die für die vollständige Charakterisierung von Glykanstrukturen geeignet sind, umfassen HILIC-MS, sowie die Trennung von 2-AB-markierten Glykanen mittels schwacher Anionenaustauscher oder porösem Graphit-Kohlenstoff, die Kapillarelektrophorese von APTS-markierten Glykanen oder das LC/MS-Peptidmapping von Glykopeptiden.

Die Chemie der amidgebundenen HILIC-Phasen ist ideal geeignet zur Trennung von geladenen und neutralen Fraktionen eines Glykanpools in einer Analyse. Die Retention von fluoreszenzmarkierten Polysacchariden auf TSKgel Amide-80 ermöglicht die Identifizierung von Glykanstrukturen durch Vergleich mit einer markierten Dextranleiter. Die Dextranleiter wird zum Normalisieren der Retentionszeiten für die Berechnung der Anzahl von Glukoseeinheiten (GU-Werte) der getrennten Glykane eingesetzt.

Abbildung 4: Dextranleiter (A), PNGaseF Spaltprodukte (B), Sequentielle- Exoglycosidase-Aufschlussprodukte (C–F). Eingesetzte Exoglykosidasen:Sialidase A (Abs), α-Fucosidase (Bkf), β-Galaktosidase (Btg), β-N-Acetylhexoamidase (Guh) TSKgel Amide-80 Säule (3 μm, 2 mm ID x 15 cm L); Mobile Phase: A: 50 mM Ammoniumformiat (pH 4,3), B: Acetonitril, 35 Minuten Gradient von 75 bis 35 % B, Flussrate: 0,22 ml/Min, Temperatur: 50° C, Detektion: Fluoreszenz; Anregung @ 360 nm, Emission @ 425 nm, Injektionsvolumen:2 μl (circa 300 fmol für GU3) Mit freundlicher Genehmigung von K. Darsow, S. Bartel & H. Lange, Universität Erlangen-Nürnberg

Die GU-Werte, die nach der Trennung der Produkte der sequentiellen Exoglykosidasespaltungen erhalten wurden, können zur Vorhersage der Glykanstrukturen mittels Datenbankabfrage (Glycobase, autoGU) eingesetzt werden. Abbildung 4 zeigt die Fluoreszenz-Chromatogramme der HILIC-Trennungen von 2-AB-markierten N-Glykanen, freigesetzt aus einem rekombinanten Konstrukt der ZP-Domäne des transformierendem Wachstumsfaktor Beta Typ 3 Rezeptors (TGFR-3), verglichen mit der Dextranleiter.

ZUSAMMENFASSUNG

Es gibt ein breites Spektrum von HPLC Anwendungen, die in Entwicklung, Herstellung, Prüfung und Freigabe von Proteintherapeutika eingesetzt werden. Einige der oben genannten Anwendungen sind obligatorisch bei der Einreichung eines neuen Biopharmazeutikums zur Genehmigung durch die Regulierungsbehörden. Die Einführung der ersten sogenannten Biosimilars in Europa steigert die Nachfrage nach hocheffizienten Analysemethoden noch weiter. Die kontinuierliche Entwicklung neuer stationärer Phasen für die üblichen Modi der Biochromatographie, wie Größenausschluss-, Ionenaustausch- und hydrophile Interaktions-Chromatographie, unterstützt Biochemiker und Analytiker bei der Steigerung der Laborproduktivität. HPLC und LC/MS basierende Hochdurchsatzmethoden können so nicht nur für kleine Moleküle, sondern auch für große Biopolymere leichter etabliert werden.

LITERATUR

  1. M. E. M. Cromwell et al., The AAPS Journal, 8(3), E572-579 (2006).
  2. T. Arakawa et al., BioProcess International, 4(10), 32–42 (2006).
  3. K. Ahrer & A. Jungbauer, J. Chromatogr. B, 841, 110–122 (2006).
  4. J.M. Harris & R.B. Chess, Nature Reviews, 2, 214–221 (2003).
  5. S. Yamamoto et al., J. Biotechnol., 132, 196–201 (2007).
  6. European Medicines Agency, EMEA/CHMP/BWP/157653/2007 (2009).
  7. P.J. Domann et al., Proteomics, 1, 70–76 (2007).
  8. L. Royle et al., Analytical Biochem., 376, 1–12 (2008).

Regina Römling ist als Marketing Manager bei Tosoh Bioscience GmbH zuständig für die Chromatographieprodukte wie HPLC-Säulen und Prozessmedien. Vor ihrem Wechsel zu Tosoh Bioscience im Jahr 2007 war sie Produktspezialist für HPLC-Systeme bei Shimadzu. Im Jahr 1990 erhielt sie ihr Diplom in Chemie, Fachrichtung Biochemie, an der Westfälischen Wilhelms- Universität Münster. Ihr Hintergrund umfasst fünf Jahre Forschungsarbeit im Bereich Molekularbiologie und Gentechnik an der Universitätsklinik Münster und 15 Jahre Berufspraxis in Flüssig-Chromatographie und Massenspektrometrie.

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