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Neuer Standard in der Elektrophysiologie und tiefer Gewebeschichten

Das Leica DM6000 CFS Confocal Fixed Stage System

Irmtraud Steinmetz und Anja Schué, Leica Microsystems

Abb. 1: Das Prinzip der Patch-Clamp-Technik. a) Es wird Druck auf die Pipette ausgeübt, um in das Gewebe einzudringen. b) Es wird Saugkraft angewandt, um einen direkten Kontakt zur Zelle herzustellen. a) und b) nach Stuart et al. (1993). c) Eine Patch-Elektrode ist mit einem Neuron verbunden, um Spannungssignale aufzuzeichnen. Eine Stimulationselektrode kann nahe an einem Dendriten platziert werden, um extrazelluläre Stimulation durch Spannungsimpulse durchzuführen. d) Schritte zur „Whole Cell“-Zell-Konfiguration: Annäherung an das Soma der Zelle, Erzeugung einer starken Abdichtung durch Druckverringerung, Aufbrechen der Membran durch kurze Anwendung von Saugkraft (Whole Cell), Füllen mit Farbstoffen oder Medikamenten ist möglich. d) aus der Doktorarbeit von Th. Nevian: “Calcium dynamics in dendrites and spines in the somatosensory „barrel“ cortex of the rat”, (Kalziumdynamik in Dendriten und Dornfortsätzen in der somatosensorischen Cortex (Barrel Cortex) der Ratte), 2003.


Die Funktion von Nerven- und Muskelzellen ist von Ionenströmen abhängig, die durch Kanäle der Zellmembran fließen. Eine Möglichkeit für die Zellphysiologie, Ionenkanäle zu untersuchen, bietet die Patch-Clamp-Technik. Mit dieser Methode können Ionenkanäle detailliert untersucht sowie die elektrische Aktivität verschiedener Zellarten aufgezeichnet werden. In erster Linie werden dabei erregbare Zellen wie Neuronen, Muskelfasern oder Betazellen der Bauchspeicheldrüse untersucht. Die Patch-Clamp-Technik wurde in den siebziger und achtziger Jahren von Erwin Neher und Bert Sakmann zur Untersuchung einzelner Ionenkanäle in lebenden Zellen entwickelt. 1991 erhielten sie für ihre Arbeit den Nobelpreis für Physiologie und Medizin. Heute ist die Patch-Clamp-Technik eine der wichtigsten Methoden auf dem Gebiet der Elektrophysiologie.

 

Großes Bildfeld kombiniert mit hoher Vergrößerung
Bei Patch-Clamp-Experimenten wird ein Bereich der Zellmembran mithilfe einer Glaspipette gegenüber der Umgebung abgedichtet. Dadurch können aus der Aktivität der Neuronen und anderer Zellen resultierende kleine Ströme und Spannungen aufgezeichnet werden (Abb.1). Ein großes Beobachtungsfeld ist erforderlich, um den gewünschten Bildausschnitt innerhalb einer Probe zu finden, beispielsweise im Gehirn einer lebenden Maus. Zudem müssen kleinste Strukturen erkennbar sein, um Pipetten und Elektroden in der Probe präzise zu positionieren.

Abb. 2: Beim Confocal Fixed Stage System Leica DM6000 CFS ist das Fixed Stage Mikroskop Leica DM6000 in die Konfokalplattform Leica TCS SP5 integriert. Das System ermöglicht sehr anspruchsvolle physiologische und elektrophysiologische Experimente.

Das Confocal Fixed Stage System Leica DM6000 CFS (Abb. 2) kombiniert das neue Leica Objektiv HCX APO L 20x/1.0 W mit hoher numerischer Apertur und geringer Vergrößerung mit Vergrößerungswechsler und CCD-Kamera. Diese Kombination erlaubt einen raschen Überblick über die Probe, während gleichzeitig ein großes Beobachtungsfeld erhalten bleibt. Außerdem kann das Beobachtungsfeld durch den Vergrößerungswechsler leicht verändert werden. Ein 20x-Objektiv bietet ein großes Bildfeld. Um einzelne Zellen zu erkennen, ist der 4x-Vergrößerungswechsler ideal. Damit kann die Pipette problemlos direkt an der Zelle positioniert werden (Abb. 3). Ist eine höhere Auflösung erforderlich, wie beispielsweise zur Untersuchung neuronaler Dornfortsätze, kann einfach in den Konfokalscanmodus umgeschaltet werden.

Abb. 3: Identifizierung von Zellen: Mit einer CCD-Kamera (Leica DFC360 FX) aufgenommene Durchlichtbilder eines Hirnschnittes (Maus) mit Dodt-Gradientenkontrast. Übersichtsbilder zur Identifizierung der interessierenden Schicht wurden mit den Vergrößerungswechslern 0,35 und 1,0 erzeugt. Einzelne Zellen wurden mit dem 4x-Vergrößerungswechsler ausgewählt.

Single Cell Electroporation (Einzelzell-Elektroporation)
Zur Untersuchung neuraler Netzwerke im Gehirn ist eine spezifische Färbung einzelner Zellen erforderlich. Mittels der neuen Methode der „Single Cell Electroporation“ (Nevian und Helmchen 2007) lassen sich Zellen schnell und selektiv färben. Kurze Spannungsimpulse erzeugen ein elektromagnetisches Feld auf der Membran. Dadurch bilden sich vorübergehend kleine Poren, die sich innerhalb von Sekunden wieder schließen. Beim Öffnen der Poren werden geladene Moleküle in Richtung des elektrochemischen Gradienten transportiert. So können Neuronen mit kalziumempfindlichen und anderen Farbstoffen gefärbt werden (Abb. 4).

Abb. 4: a) Ein spezifisches Neuron wurde mithilfe von Einzelzell-Elektroporation mit einem kalziumempfindlichen Farbstoff gefärbt. Überlagerung einer mit einem Non-Descanned Detector (NDD) erstellten Fluoreszenzaufnahme mit einer Durchlichtaufnahme. b) kleines neurales Netzwerk: Hirnschnitt (Ratte), Schicht 5, rot: Interneuronen Alexa 594, grün: Pyramidalzelle Oregon green Bapta-1(kalziumempfindlich), Z = 123 μm, Zwei-Photonen-Anregung; Detektion mit 2-Kanal-NDD. Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Thomas Nevian, Inst. für Physiologie, Universität Bern, Schweiz.

Bei der Single Cell Electroporation ist die Hintergrundfärbung im Vergleich zu intrazellulären Aufzeichnungselektroden oder Patch-Pipetten geringer. Die Technik der Single Cell Electroporation eignet sich besonders gut für die funktionale Darstellung der subzellulären Ca²+-Dynamik in vitro und in vivo. Mehrere Substanzen können eingebracht werden, um gleichzeitig morphologische und funktionale Messungen durchzuführen. Außerdem lassen sich mehrere Zellen nacheinander färben, um kleine neurale Netzwerke unter Verwendung derselben Pipette darzustellen.

 

Zuordnung optischer und elektrischer Daten – und Bilder
Bei vielen physiologischen Anwendungen interessiert die Reaktion der Zellen auf unterschiedliche Arten von Stimuli. Die an elektrischen Daten und Fluoreszenzintensitätsdaten erkennbaren Reaktionen der Zellen müssen synchronisiert gemessen und angezeigt werden. Die Intensitätsdaten beziehen sich normalerweise auf die intrazelluläre Kalziumkonzentration oder den pH-Wert. Das Leica DM6000 CFS ermöglicht die synchronisierte Korrelation elektrischer und optischer Daten. Spannungswerte werden synchron den Fluoreszenzintensitätsdaten zugeordnet und automatisch in Form von Diagrammen angezeigt. Dies liefert einen schnellen und direkten Überblick über den experimentellen Fortschritt sowie die Online-Auswertung der Daten. Außerdem zeigt das System unterhalb der Diagramme Mikroskopbilder zur Morphologie der Zelle an.

Abb. 5: Quantifizierung des im Text beschriebenen Experiments. Während eines Patch-Clamp-Experiments an einem Kardio-Myozyten aufgenommenes Intensitätsdiagramm (oben), elektrische Daten (Mitte) und Mikroskopbilder (unten). Die Zellen wurden mit unterschiedlichen Stimulationsprotokollen angeregt, und ihre Reaktionen anhand der Ionenströme und der Intensität der Kalziumsignale innerhalb einer ROI (region of interest) gemessen. Gemessener Strom (lila), Anregungstriggerimpulse (rot) und Zeilen-Trigger (grün).

Eine Datenaufnahmebox und eine Leica Trigger-Einheit sind feste Bestandteile des Systems zur Anzeige der Intensitäts- und Spannungsdatenkorrelaton. Die aufgenommenen Signale, beispielsweise von einem Neuron, werden normalerweise verstärkt, und anschließend an eine Datenaufnahme-Box (DAQ-Box) gesendet, wo die Signale digitalisiert werden. Zur Synchronisation mit dem Scan-Prozess ist die DAQ-Box mit der Trigger-Einheit verbunden. Sie ist außerdem mit dem PC verbunden, sodass korrelierte optische und elektrische Daten sowie Mikroskopbilder angezeigt werden können.

 

Ionen- und Kalziumströme in Herzmuskelzellen
In einem Experiment wurden isolierte Kardio-Myozyten von Forellen mit dem kalziumempfindlichen Farbstoff Fluo4 gefärbt und mithilfe eines Triggerimpuls-Protokolls unter Verwendung der Patch-Clamp-Technik (HEKA EPC-10 double) stimuliert. Die Reaktionen der Kardio-Myozyten auf die intrazelluläre Kalziumkonzentration und auf Ionenströme wurden mithilfe von Fluoreszenzbildgebung und der Aufzeichnung elektrischer Signale gemessen. Das Stimulationsprotokoll am Patch-Clamp-Aufbau wurde mit konfokalen Zeitserien synchronisiert, indem mithilfe eines Triggers am Patch-Clamp-Aufbau Ereignisse in Einzelbildern auf der Zeitachse markiert wurden. Zeilentrigger werden aufgezeichnet, um eine genaue Zuordnung von Scanbild, Intensität des Fluoreszenzsignals und elektrischer Antwort der Zelle zu erhalten (Abb. 5). Der Scankopf generiert diese Trigger automatisch. Das bedeutet: Beim Scannen jeder Zeile wird der zugehörige Trigger-Impuls aufgezeichnet und in der Quantifizierungsgrafik angezeigt. Das Synchronisieren der Bilder und ausgelösten Impulse erfolgt mithilfe der DAQ Box.

Multiphotonen-Mikroskopie und externe Detektoren
Analysen von Zellen tieferer Gewebeschichte stellen für die Physiologie eine große Herausforderung dar. Die Multiphotonen-Mikroskopie bietet hierzu im Vergleich zur Konfokalmikroskopie mehrere Vorteile. geringere Lichtstreuung, begrenztes Anregungsvolumen und geringeres Bleichen in der Fokusebene sowie geringere Phototoxizität. Hirnschnitte streuen beispielsweise sehr stark und haben normalerweise eine Dicke von mehreren Hundert Mikrometern. Daher ist ihre Visualisierung mithilfe eines Standard-Konfokalmikroskops sehr schwierig. Aufgrund der effizienteren Erfassung von Photonen sind dickere Proben mithilfe der Multiphotonen-Mikroskopie gut darstellbar.

Abb. 6: Ein Leica DM6000 CFS System mit externen Detektoren (NDDs). Bilder: Selektiv markierte Neuronen in einem 300 μm dicken lebenden Hirnschnitt (Maus), mit IR-Licht angeregt. Zwei Neuronen in einem mit Oregon green Bapta-1 gefärbten lebenden Hirnschnitt. Detektion der Fluoreszenz durch RLD und TLD. Der TLD zeigt ein deutlich helleres Signal. Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Thomas Nevian, Inst. für Physiologie, Universität Bern, Schweiz.

Bei der Konfokalmikroskopie wird sowohl das Fluoreszenzlicht ober- und unterhalb der Fokusebene als auch das gestreute, diffuse Licht durch die Lochblende ausgeschlossen. Bei der Multiphotonen-Mikroskopie ist keine Konfokal-Lochblende erforderlich, da das gesamte fluoreszente Licht ausschließlich vom Fokuspunkt kommt. Das von der Probe emittierte Licht muss das Mikroskop nicht erneut durchlaufen. Deshalb können die Detektoren so nah wie möglich bei der Probe platziert werden, um die Photonen sehr effizient zu erfassen.

Die externen Non-Descanned Detectors (NDDs) enthalten PMTs (Photomultiplier Tubes) zur Erfassung von fokussiertem und gestreutem Fluoreszenzlicht. Sie können zwei oder vier verschiedene Fluoreszenzsignale detektieren (2- oder 4-Kanal-NDD). Zur Trennung der Signale sind mehrere Filterwürfel verfügbar (Abb. 6).

Fluoreszenz und kontrastreiches Durchlicht
Nicht gefärbte Neuronen in dicken Hirnschnitten sind Phasenobjekte. Um sie sichtbar zu machen, ist die Umwandlung ihrer Phasengradienten in Amplitudengradienten erforderlich. Der differentielle Interferenz-Kontrast (DIC) mit Prismen und Polarisationsfilter im Strahlengang ist eine Methode, dies zu erreichen. Bei gleichzeitiger Darstellung von Durchlicht und Fluoreszenz verringert sich dabei allerdings aufgrund der optischen Komponenten im Strahlengang die Effizienz der Photonen-Erfassung.

Abb. 7: Herz (Maus) wurde exzidiert, und ein 1 mm dicker Schnitt des Organs wurde mit zweiprozentigem Agarose-Gel umhüllt. Es wurde Zwei-Photonen-Anregung mit 840 nm verwendet. Die Fluoreszenzfärbung der Zellkerne erfolgte mit Syto13 (grün). a) Übersichtsbild, Zellkerne von Kardio-Myozyten sind sichtbar. Die Kern-Fäden gehören zu Endothelialzellen in den Kapillaren in der Umgebung der Kardiomyozyten. In Rot ist das Second Harmonic Generation-Signal von Kollagen in den Kapillaren sichtbar. Der schwach rötliche Hintergrund zeigt die Auto-Fluoreszenz der Kardiomyozyten. b) Zoom-Bild; das Second Harmonic Generation-Signal von Kollagen und seine Zugehörigkeit zu Endothelialzellen ist deutlicher sichtbar. Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Marc van Zandvoort, Biophysik, Universität Maastricht, Niederlande.

Die Infrarot-SGC-Bildgebung (Scanning Gradient Contrast) – auch als Dodt-Kontrast bezeichnet – ist eine weitere Methode zur Darstellung nicht gefärbter Zellen in dickem, streuendem Gewebe. Hans-Ulrich Dodt (Max-Planck Institut, München) hat dieses spezielle optische System entwickelt. Bei dieser Technik kann der Kontrast so eingestellt werden, dass verschiedene horizontale oder vertikale Strukturen hervorgehoben werden.

Die Dodt-Gradientenkontrastmethode erfordert keine optischen Komponenten im Strahlengang, um kontrastreiche, hoch aufgelöste Bilder zu erzeugen. Hier wird die Apertur-Ebene des Kondensors durch ein Linsensystem zwischen Mikroskop und Lampengehäuse dargestellt. Räumliches Filtern erfolgt durch einen Viertelringspalt im Strahlengang. Auf den Ringspalt folgt ein Diffusor, der eine Schräglichtbeleuchtung über die Kondensor-Apertur erzeugt. Die Blende blockiert einen großen Teil des Beleuchtungslichts, und nur ein Teil des Lichtkegels wird genutzt. Daher wird weniger Streulicht im Schnitt generiert. Für hoch aufgelöste Bilder kann ein Öl-Immersions-Kondensor mit 1.4 NA verwendet werden. Dabei lassen sich die Ausrichtung des räumlichen Filters und der Abstand zwischen Diffusor und dem Viertelringspalt variieren.

Abb. 8: Zeitserie der Einzelzell-Elektroporation eines Pyramidalneurons mit Kalziumindikator (Ca²+) Oregon green Bapta-1: Überlagerung des Fluoreszenzkanals (Non Descanned Detector) und des Durchlichtkanals bei gleichzeitiger Aufnahme mit IR-Licht. Bilder in Intervallen von 280 ms aufgenommen. Schematische Zeichnung im ersten Bild zeigt den experimentellen Aufbau. Einzelimpuls von -15 V wird mit einer Dauer von 10 ms generiert. (Nevian und Helmchen, 2007). Der Vorteil des Scangradientenkontrasts ist offensichtlich: Er erleichtert die gleichzeitige Darstellung der Zellstruktur und des Färbeprozesses mit dem Fluoreszenzfarbstoff.

So entsteht ein sehr starker Kontrast, ähnlich DIC-Bildern. Dodt-Gradientenkontrastbilder werden mit einem Durchlichtdetektor bzw. Dodt-Detektor erkannt. Der PMT des Dodt-Detektors weist im Vergleich zu regulären PMTs eine höhere IR-Empfindlichkeit (bis ca. 900 nm) auf. Wird eine IR-Anregung eingesetzt, kann das Leica DM6000 CFS mit NDDs und Dodt-Detektor gleichzeitig Fluoreszenz und Durchlicht detektieren. Dies ergibt höchste Effizienz der Photonenerfassung und erleichtert viele Anwendungen in der Physiologie, wie beispielsweise optisch kontrolliertes Patch-Clamping (Abb. 8). Der Dodt-Gradientenkontrast funktioniert bei IR-Anregung im Kamera- sowie im Scanmodus. Er kann auch in Kombination mit VIS-Anregung verwendet werden, jedoch ist die Kontrastwirkung dann deutlich geringer.

Literatur
H.U. Dodt und W. Zieglgänsberger, 1990. Visualising unstained neurons in living brain slices by infrared DIC videomicroscopy. Brain Research, 537(1-2): 333-6
G. Stuart und B. Sakmann, 1993. Patch-clamp recordings from the soma and dentrides of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflügers Archive – European Journal of Physiology, 423: 511-518
W. Denk, 1996. Two photon excitation in functional imaging. Journal of Biomedical Optics 1 (3), 296-304
Th. Nevian, 2003. Doktorarbeit: Calcium dynamics in dendrites and spines in the somatosensory “barrel” cortex of the rat
Th. Nevian und F. Helmchen, 2007. Calcium indicator loading of neurons using single cell electroporation. Pflügers Archiv – European Journal of Physiology, 454: 675-688

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