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Interferenzen und HAMA-Probleme

Erkennen und Vermeiden von falschen Ergebnissen

Dr. Tobias Polifke, Dr. Peter Rauch
CANDOR Bioscience GmbH, Weissensberg

Immunoassays sind bioanalytische Nachweis-Verfahren mit Hilfe von Antikörpern. Zu den Immunoassays gehören bioanalytische Methoden wie z.B. ELISA, EIA, RIA, Western Blots, Protein-Biochips bzw. Protein Arrays, Lateral Flow Assays (Immun-Chromatographie), die Immunhistochemie oder auch die Immuno-PCR. Die Substanzerkennung bei Immunoassays erfolgt hochspezifisch über die Assay-Antikörper, die ausschließlich und spezifisch ihren jeweiligen Analyten als Antigene erkennen und binden. Soweit die Theorie. In der Praxis bindet jeder Antikörper nicht nur seinen Analyten, sondern auch diverse andere Substanzen, jedoch mit äußerst unterschiedlichen Affinitäten. Zusätzlich werden Antikörper ihrerseits von diversen Molekülen aus biologischen Proben gebunden, maskiert oder auch vernetzt. Prominentestes Beispiel solcher vernetzender Bindemoleküle aus biologischen Matrices dürften heterophile Antikörper wie z.B. humane Anti-Maus Antikörper (HAMAs) sein. Aber auch Rheumafaktoren gehören zu diesen vernetzenden Substanzen, die häufig bei Patienten vorkommen. Nicht nur die Antikörper, sondern auch die Analyten können ihrerseits an andere Moleküle gebunden und somit maskiert sein. Hierfür ist das häufig in hohen Konzentrationen vorkommende C-reaktive Protein (CRP) nur ein Beispiel, auch viele andere Maskierungen kommen vor, nicht nur in Patientenproben im Bereich der Diagnostik, sondern in quasi jeder biologischen Probe, z.B. auch in tierischen oder pflanzlichen Proben. Betroffen sind also Assays für die Human-Diagnostik, für die Veterinär-Diagnostik, für die medizinische und biologische Forschung, für die Pharmaforschung, für toxikologische Untersuchungen oder auch die Lebensmittel-Analytik. Daher soll hier zunächst ein Überblick über die diversen Gruppen von Interferenzen genauso gegeben werden, wie ein möglicher Lösungsansatz erläutert werden. Praktische Beispiele zeigen, daß durch Einsatz des modernen Assay-Diluents LowCross-Buffer® Störungen selbst durch heterophile Antikörper, HAMAs, Rheumafaktoren, aber auch durch unbestimmte Störeffekte wirksam verhindert werden können. Die Ergebniszuverlässigkeit und die Präzision steigen und Nachweisgrenzen können verbessert werden.


Abb. 1 zeigt schematisch diverse verschiedene Ursachen für Interferenzen. Matrixeffekte, Kreuzreaktivitäten und viele andere sind schematisch gezeigt. Eine genauere Erläuterung hierzu findet sich in einem Artikel aus LABORWELT, der auf www.candor-bioscience.de zum Download bereit steht. Hier findet sich auch eine ausführliche Legende zu der gezeigten Abbildung.

Im Folgenden sind kurz einige Gruppen von Interferenzen genannt:

Störungen durch Immunoassay Label

Die Markierung von Detektor-Antikörpern durch Enzyme, wie z.B. die Meerrettich-Peroxidase (horse radish peroxidase = HRP) oder die alkalische Phosphatase (alkaline phosphatase = AP), durch Biotinylierung, durch DNA (Immuno-PCR) oder durch Farbstoffe, wie Fluoreszenzfarbstoffe, kann zu Störungen führen. Durch die Markierungen können die Antikörper in ihrer Bindefähigkeit verändert werden. Dies tritt besonders bei hohen Labelgraden häufig auf. Aber auch die Label selbst binden untereinander, an Antikörper oder mitunter unspezifisch an Proben-Bestandteile. Besonders häufig ist dies bei Fluoreszenzfarbstoffen zu beobachten, die aufgrund von hydrophoben Wechselwirkungen mitunter regelrechte Verklumpungen von Antikörpern hervorrufen können. All dies führt zu schlechter Assay-Performance.

Störungen durch Kreuzreaktivität und unspezifische Bindungen

Mit Kreuzreaktion bezeichnet man das Binden eines Antikörpers an einen anderen als den gewünschten Analyten. Diese Bindung ist häufig von deutlich geringerer Affinität als die eigentliche Analyt-Bindung, trägt aber trotzdem zum Gesamtsignal bei und verfälscht so die Messung. Sehr unangenehm sind die Kreuzreaktionen von Sekundärantikörpern, da diese mit Antikörpern aus verschiedenen Spezies kreuzreagieren können und hierbei teilweise hohe Affinitäten zeigen. Durch Verwendung sog. prä-adsorbierter Sekundärantikörper lässt sich dieses Problem umgehen.

Unspezifische Bindungen sind in Ihrer Wirkung ähnlich zu Kreuz-Reaktivitäten, beeinflussen den Assay aber meist erst beim Vorkommen höherer Konzentrationen des unspezifischen Binders. Bekannt ist die unspezifische Bindung an Oberflächen, wie ELISA-Platten, wie sie z.B. durch Blockierung mit modernen, gleichmäßig gespaltenen Casein-basierten Blockieren (z.B. The Blocking Solution von CANDOR Bioscience) optimal verhindert werden kann. Aber auch Albumine oder Immunglobuline und allgemein alle anderen in mittlerer bis hoher Konzentration gelösten in einer Probe vorkommenden Substanzen können solche Effekte hervorrufen. Diese in hohen Konzentrationen vorkommenden löslichen Komponenten können unspezifisch an den Analyten oder die Assay-Antikörper binden und dadurch das Messergebnis verfälschen. Bei gelösten Substanzen kann unspezifische Bindung nicht durch Oberflächen-Blockierer verhindert werden.

Störungen durch Matrixeffekte

Matrix-Effekte sind die Summe der Störeffekte aller Komponenten, die in einer Probe vorkommen und die Messung des Zielanalyten beeinflussen. Wenn die genaue molekulare Ursache einer Störung nicht bekannt ist, aber mit der Zusammensetzung der zu vermessenden Probe in Verbindung gebracht werden kann, spricht man im Allgemeinen von einem Matrixeffekt. Auch hier sind die Übergänge zu den einzelnen Störeffekten fließend. Für Matrixeffekte können „Anti-Animal-Antibodies“, heterophile Antikörper, endogene Störer oder Einflüsse der Viskosität, des pH-Werts oder der Salzkonzentration verantwortlich sein.

Störungen durch „Anti-Animal-Antibodies“

Humane Anti-Animal-Antibodies (HAAA) können vom IgG-, IgA-, IgM- oder IgE-Typ sein und werden als Immunantwort auf den Kontakt mit Immunglobulinen tierischen Ursprungs gebildet. HAAA’s sind als wichtige Störer bei vielen diagnostischen Immunoassays bekannt und bis zu 80% aller Patientenproben können – je nach veröffentlichter Studie - HAAA’s enthalten, die zudem Konzentrationen bis in den Bereich von einigen Milligramm pro Milliliter erreichen können. Aufgrund der hohen Sequenzähnlichkeit zwischen den Antikörpern verschiedener Spezies sind HAMA-haltige Seren eventuell auch in der Lage, Assays zu stören, in denen Antikörper aus anderen Spezies verwendet werden. Die gleiche Form der Störung durch Quervernetzung wird durch diverse heterophile Antikörper aber auch durch die sog. Rheumafaktoren verursacht. Die Häufigkeit dieser Störungen in der Diagnostik nimmt derzeit rapide zu aufgrund steigender Patientenzahlen von Autoimmun-, rheumatischen oder auch allergischen Erkrankungen. Zusätzlich führt die therapeutische Gabe von Antikörpern z.B. in der Onkologie (Blockbuster-Status diverser Medikamente, also hohe Pateintenzahlen) zu massiven Steigerungen dieses Störerbildes. Gerade in der Diagnostika-Produktion muss derzeit verstärkt auf dieses Problem reagiert werden. Bislang wurden häufig sogenannte HAMA-Blocker eingesetzt. Jedoch werden dadurch aktive biologische Substanzen den Assays zugegeben, was mitunter zu ganz anderen Störungen führen kann. Auch gegen Störungen durch Heterophile und viele andere quer-vernetzende Störer kann LowCross-Buffer® als Assay-Puffer, Antikörper-Verdünnungspuffer oder auch Proben-Puffer wirksam eingesetzt werden.

Störungen durch endogene Bestandteile der Probe

Auch natürlich vorkommende Proteine der Realprobe können Immunoassays stören. Bekannte Störer in humanen Seren sind beispielsweise Albumine, Komplement, Lysozyme, Fibrinogen oder Proteine wie c-reaktives Protein (CRP) oder Alpha-1-Antitrypsin. Niedermolekulare Analyte können an Albumin binden. Dies erschwert die Zugänglichkeit des Antikörpers zu dem Analyten. Zahlreiche Hormone liegen an Transportproteine gebunden vor. Dies kann je nach verwendeten Antikörpern zu Schwierigkeiten führen. Zudem haben viele natürlich vorkommende Proteine die Fähigkeit andere Substanzen bzw. Proteine zu binden. Oft ist diese Bindefähigkeit wesentlicher Teil der Funktion des jeweiligen Proteins. Albumin, Komplement und CRP sind für viele Substanzen natürliche Rezeptoren. Daher sind hier – ähnlich wie bei den Antikörpern – unspezifische Bindungen und auch Kreuzreaktionen denkbar, die die Erkennung bestimmter Analyte in einem Assay erschweren. Endogene Proteine können als Störer an die Assayantikörper binden oder den Zielanalyten für die Assayantikörper maskieren. Lysozyme beispielsweise binden unspezifisch an Proteine mit einem niedrigen isoelektrischen Punkt. Daher können auch Antikörper, die einen isoelektrischen Punkt von ca. 5 haben, gebunden werden und beispielsweise Brückenbildung zwischen Fänger- und Detektorantikörper auslösen. Ein wichtiger Aspekt, der in diesem Zusammenhang noch erwähnt werden sollte, sind Störungen durch stark lipidhaltige Proben, da manche Analyte gut fettlöslich sind bzw. die Antikörper-Analyt-Bindung durch Lipide gestört werden kann.

Der Hook-Effekt

Der high-dose Hook-Effekt führt zu falsch-negativen Bestimmungen, die aber im Gegensatz zu den anderen Störeffekten nicht durch Interaktionen mit Störfaktoren entstehen. Ein Hook-Effekt kann bei Assays auftreten, bei denen die Probe direkt mit den Assayantikörpern gemischt wird und der Analyt in sehr hohen Konzentrationen auftreten kann. In einem solchen Fall können hohe Konzentrationen des Analyten, die eventuell höher sein können als die Konzentrationen der Assayantikörper, die Fänger- und Detektorantikörper absättigen. Somit simulieren hohe Konzentrationen eine weitaus niedrigere Konzentration im Assay und hieraus folgt eine deutliche Unterbestimmung der wahren Konzentration. In der Praxis kann man einen Hook-Effekt dadurch vermeiden, dass man eine höhere Konzentration der Assayantikörper verwendet oder mit einer höheren Verdünnung der Probe arbeitet. Alternativ muß man durch systematische Verdünnung der Probe sicherstellen, dass der gemessene Wert nicht einem Hook-Effekt unterliegt. Bekannte klinische Parameter, die einem Hook-Effekt unterliegen können, sind beispielsweise CRP, AFP, CA 125, PSA, Ferritin, Prolactin und TSH.

Vermeidung der Störeffekte durch LowCross-Puffer

Die Ursache der großen Mehrheit der beschriebenen Störeffekte sind unerwünschte niederaffine bis mittelaffine Interaktionen der störenden Faktoren mit den Antikörpern oder den Analyten, bzw. nieder- bis mittelaffine Bindungen von gelabelten Antikörpern zu anderen Proteinen oder Oberflächen, oder schwache bis mittlere Kreuzreaktivitäten der Antikörper zu strukturverwandten Substanzen. Daher unterliegen diese Störeffekte einer Gemeinsamkeit, die der neuentwickelte LowCross-Buffer® ausnutzt: die störende Bindung ist schwächer als die spezifische Bindung zum eigentlichen Zielanalyten. LowCross-Buffer® wurde gezielt entwickelt, um generell schwache und mittlere Bindungen zu verhindern und möglichst nur hochaffine Bindungen mit hoher Spezifität zu zulassen. Die Abbildungen 2 bis 4 zeigen verschiedene Beispiele von typischen Störeffekten bei Immunoassays, die durch Verwendung von LowCross-Puffer verhindert werden konnten.

 


Abbildung 2 ist ein Beispiel eines ELISA gegen Immunglobulin aus Meerschweinchen (Daten freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. C. Specht, PARA Bioscience, Gronau), der für immuntoxikologische Studien mit Meerschweinchen eingesetzt wird, bei dem falsch-positive Bindungen in der Spezifitätskontrolle (Reihe A1-A12) sowie beim Leerwert (H1-H12) die Interpretation und Auswertung unmöglich machten. Die Verwendung von LowCross-Buffer verhinderte die falsch-positiven Bindungen und ermöglichte zudem den Nachweis der Konzentrationsabhängigkeit in den Reihen B bis G 1-6 bzw. B bis G 7-12. Details hierzu im oben erwähnten Artikel aus LABORWELT.


Abbildung 3 zeigt in einem Präzisionsprofil die deutliche Verbesserung der Ergebniszuverlässigkeit. Gezeigt ist das Präzisionsprofil eines ELISA zum Nachweis eines Proteins aus Blutproben, der zum Zwecke der Pharmaforschung entwickelt wurde. Dieser ELISA wurde gemäß Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation der FDA validiert. Die geforderte Präzision im gesamten Messbereich konnte nur durch Einsatz von LowCross-Buffer® erzielt werden.


Abbildung 4 zeigt die Vermeidung von Störungen durch HAMAs sowie durch Rheumafaktoren. Das CE-gekennzeichnete Diagnostikum „HAMA-ELISA“ wurde genutzt, um die Wirksamkeit von LowCross-Buffer® gegen Heterophile zu demonstrieren. Es wurden komplette Panels von kommerziell erhältlichen HAMA-Seren und Rheumafaktor-Seren (in.vent Berlin und Scantibodies, USA) vermessen. LowCross Buffer® konnte in allen vermessenen Seren die Störeffekte vollständig eliminieren (Signal unterhalb 40 ng/ml laut Herstellerangaben). Hier sind exemplarisch die Ergebnisse eines Rheuma- sowie eines HAMA-Serums gezeigt.

Fazit

Mit dem heutigen Stand der Technik lassen sich viele Störeffekte minimieren und hierzu ist die Entwicklung des LowCross-Buffer® ein wesentlicher Beitrag. Neuartig ist, dass nun verschiedene Störeffekte mit unterschiedlichen molekularen Ursachen gleichzeitig minimiert werden können und LowCross-Buffer® bei unterschiedlichen Immunoassays anwendbar ist. Die hier gezeigten Ergebnisse sind ein Ausschnitt aus diversen Störeffekten bei unterschiedlichen Methoden, die mit LowCross-Buffer® minimiert bzw. vermieden werden konnten. Ebenfalls konnten Störeffekte durch HAMA und Rheumafaktoren, unspezifische Bindungen bei immunhistochemischen Anwendungen sowie falsch-positive Bindungen bei Immuno-PCR, durch LowCross-Buffer® verhindert werden. Es können nun zeit- und kostenaufwendige Optimierungsstrategien verkürzt und vereinfacht werden, wobei gleichzeitig eine Verbesserung der Ergebniszuverlässigkeit erreicht wird. HAMA Blocker können ersetzt werden. LowCross-Buffer® wird in diversen präklinischen und klinischen Studien sowie zur Produktion von Diagnostika mit verbesserter Zuverlässigkeit eingesetzt.

Da für ELISA-Kits und ähnliche Produkte die Detektor-Konjugate über lange Zeit bei 4°C stabil gelagert werden müssen, hat CANDOR In dem neuen Produkt LowCross-HRP® den LowCross-Effekt mit der Stabilisierungstechnologie von CANDOR Bioscience für HRP-Konjugate kombiniert. Diese Kombination in einer Lösung ermöglicht Kits mit bislang unbekannter Ergebniszuverlässigkeit und gleichzeitig hervorragender Stabilität über mehrere Jahre. Sichere und stabile Langzeit-Lagerung der Konjugate bei 4°C ist auch möglich, wenn diese direkt in extrem niedrigen Endkonzentrationen gelagert werden. Dies vermeidet für den Anwender lästige Vor-Verdünnungen vor der Durchführung von Assays.

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