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Biosensoren verfolgen GPCR-Aktivierung anhand zweier Second Messenger in Zellen und in Echtzeit

CLARIOstar Mikroplatten-Reader misst fluoreszente Biosensoren, die sekundäre Botenstoffe anzeigen

Dr. Andrea Krumm

Schema des DAG Sensors

Aufgrund ihrer Bedeutung bei der Übersetzung extrazellulärer Stimuli in intrazelluläre Reaktionen, sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) wichtige Ziele für neue Medikamente. Wird ein Rezeptor des Gq-Typs stimuliert, kommt es zur Aktivierung von Phospholipase C (PLC). Das Enzym hydrolysiert Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) zu Diacylglycerin (DAG) und führt schlussendlich zur Freisetzung von Ca2+ ins Cytoplasma.

Neuartige Biosensoren der Firma Montana Molecular reagieren auf die Anwesenheit der sekundären Botenstoffe Ca2+, PIP2 und DAG. Die genetisch codierten Sensoren sind in rot- oder grün-fluoreszierender Version erhältlich und können mit steigender Analytenkonzentration wahlweise in ihrer Fluroeszenz zu- oder abnehmen. Diese Variabilität erlaubt es mehrere Sensoren gleichzeitig zu messen um beispielsweise zwei Gq-assozierte second Messenger zu beobachten.

Die Biosensoren wurden in HEK293-Zellen exprimiert. Deren Acetylcholinrezeptor wurde mit Carbachol aktiviert, was zur Bildung beziehungsweise Freisetzung von DAG, PIP2 und Ca2+ führte. Die Biosensoren zeigten die Änderung der sekundären Botenstoffe an und wurden mit dem CLARIOstar® Mikroplatten-Reader aufgenommen. Dieser erwies sich als idealer Detektor: Filter- und Monochromator-basierte Messungen bewährten sich als empfindlich und schnell genug um selbst rasche Ca2+ Antworten zu detektieren.

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  • G-Protein-gekoppelt…
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  • Phospholipase C
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