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Detektion von Protein-Protein-Interaktion im Hochdurchsatzverfahren

Messungen in Mikroplatten-Readern sparen gegenüber radioaktiven Methoden Kosten und Zeit

Dr. Franka Maurer

Die Reaktion einer Zelle auf einen Reiz von außen ist ein Forschungsschwerpunkt für viele Molekularbiologen.  Als Vermittler zwischen Stimulus und Zellantwort dienen Rezeptoren sowie sekundäre Botenstoffe (second messengers). Besonders hervorzuheben sind dabei die membranständigen G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Bis zu 50-60 % der kommerziell erhältlichen Medikamente nehmen Einfluss auf GPCRs1. Dank ihrer enormen Bedeutung werden GPCRs noch über Jahre hinweg im Fokus der pharmazeutischen Industrie stehen. Umso mehr bedarf es geeigneter Methoden, um die Wechselwirkung von  Ligand und Rezeptor zu messen. Jede Pharmafirma hat Zugang zu Datenbanken mit einer Vielzahl von Substanzen. Alle Substanzen sollen auf ihre Eignung als potentieller Ligand oder als potentieller Inhibitor eines Liganden untersucht werden. Um möglichst viele Proben in möglichst kurzer Zeit zu testen, werden „Compound Screenings“ fast immer mit Mikroplatten-Readern durchgeführt, die die automatische Messung im Hochdurchsatzverfahren ermöglichen.

Es gibt mehrere etablierte Methoden, um die Bindung eines Liganden an einen Rezeptor zu untersuchen. Früher wurden dafür oft radioaktiv markierte Liganden benutzt. Diese Methode liefert zwar sehr genaue Ergebnisse, beinhaltet jedoch auch zahlreiche Nachteile. Für die Benutzung von radioaktiven Materialien ist eine spezielle Ausrüstung nötig, und es sind aufwändige Abfallvorschriften einzuhalten. Dazu kommen Kosten für die radioaktive Markierung der Substanzen sowie für die Überwachung der Strahlenbelastung der Mitarbeiter. Der Hauptgrund für die Suche nach alternativen Methoden liegt jedoch in der Tatsache, dass die radioaktiven Messungen nicht mit einem Hochdurchsatzscreening vereinbar sind.

Messung der Ligandenbindung im Hochdurchsatzverfahren

Darstellung der G/s bzw. Gq Signalwege nach Bindung eines Liganden an einen GPCR

Nichtradioaktive Techniken wie Fluoreszenz- und Lumineszenzassays sind dagegen für die Messung in Mikroplatten im Hochdurchsatzverfahren geeignet. Dabei gibt es unterschiedliche Ansätze. So kann man entweder direkt die Wechselwirkung von Ligand und Rezeptor messen, oder es wird die Konzentration eines second messengers quantifiziert, der sich über die Signalübertragungskette nach der Interaktion von Ligand und Rezeptor in der Zelle vorübergehend anreichert, z. B. cAMP oder IP1 (Abb. 1).

Fluoreszenz-basierte Methoden zum Nachweis einer Protein-Protein-Wechselwirkung

Nachdem ein Ligand am Rezeptor bindet, kommt es zu einer Konformationsänderung des Rezeptors. Die Untereinheiten der gekoppelten G-Proteine dissoziieren und aktivieren weitere Proteine. Auf diese Weise wird das Signal transportiert. Dabei erfolgt auch eine Änderung der Ausrichtung von Aminosäuren, wie z.B. Tryptophan. Durch die Messung der intrinsischen Tryptophanfluoreszenz kann die Konformationsänderung mitverfolgt werden und so auf eine erfolgreiche Ligandenbindung oder auf eine Hemmung der Ligandenbindung geschlossen werden (Abb. 2). Der Vorteil dieser Methode ist, dass sie „label-free“ funktioniert, also keine Substanz mit einem Fluoreszenzfarbstoff versehen werden muss.

Darstellung eines intrinsischen Tryptophans (Trp211) in der switch II Region eines inaktiven (gelb) bzw. aktiven (orange) Gα-Proteins

Eine besondere Form der Fluoreszenz ist die FRET-Methode. FRET steht für Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer. Es werden zwei verschiedene Fluorophore benötigt. Je ein Fluorophor wird an eines der beiden Proteine, deren Interaktion untersucht werden soll, gebunden. Nach Anregung des ersten Fluorophors wird die Emissionsenergie auf das zweite Fluorophor übertragen – sofern die zu untersuchenden Proteine miteinander interagieren. Nur in diesem Fall kann dann das Emissionssignal des zweiten Fluorophors gemessen werden (FRET-Signal). Hilfreich im Hochdurchsatz-Ansatz sind Mikroplatten-Reader, die die beiden FRET-Emissionen zeitgleich messen können (Simultane Doppelemission). Abbildung 3 zeigt ein Inhibitor-Screening, das anhand einer solchen FRET-Methode durchgeführt wurde. Die Fluoreszenzfarbstoffe CFP und YFP wurden verwendet, um Substanzen zu finden, die die Interaktion der Gα-Untereinheit mit GoLoco-Proteinen inhibieren.

CFP-YFP-FRET Inhibitorscreen über 57 Substanzen in Anwesenheit von GDP bzw. Aluminiumtetrafluorid (AlF4-) gemessen mit einem POLARstar Omega Mikroplatten-Reader

Fluoreszenz-basierte Methoden sind geeignet, um Rezeptor-Liganden-Bindungen nachzuverfolgen und potentielle Aktivatoren oder Inhibitoren in einem Screening mit Hilfe von Mikroplatten-Readern zu finden. Dafür muss der Fluoreszenzfarbstoff mit Hilfe einer Blitzlampe oder eines Lasers angeregt werden. Bei einer hohen Eigenfluoreszenz der Zellen entsteht oft ein starkes Hintergrundsignal, wodurch der Messbereich  des Assays sehr klein ausfallen kann.

Zeitaufgelöste Fluoreszenz

Mit Hilfe der zeitaufgelösten Fluoreszenz (engl. time-resolved fluorescence TRF) wird das Hintergrundsignal auf ein Minimum reduziert. Für diese Methode werden Lanthanide eingesetzt (z.B. Europium oder Terbium), die im Gegensatz zu Standardfluorophoren eine sehr langlebige Fluoreszenz zeigen. Dadurch ist es möglich erst dann mit der Messung zu beginnen, wenn das Hintergrundsignal bereits abgeklungen ist. Die langlebigen Fluorophore sind mit einem Fluoreszenzakzeptor kombiniert, der die Emissionsenergie der Lanthanide aufnimmt und selbst ein Emissionssignal bei einer höheren Wellenlänge abgibt. Ähnlich der FRET-Methode kann auch hier nur dann ein Energietransfer stattfinden wenn sich Donor und Akzeptor in unmittelbarer Nähe zueinander befinden, also die zu untersuchende Wechselwirkung stattfindet. Diese Methode wird vor allem dazu verwendet, die Konzentration von second messengers wie cAMP oder IP1 zu bestimmen, die nach der Bindung des Liganden an einen GPCR in der Zelle gebildet werden und für die Weiterleitung des Signals sorgen. Mit Hilfe von Mikroplatten-Readern, die in der Lage sind, zwei Emissionssignale parallel zu erfassen, ist es möglich, die Signale von cAMP und IP1 gleichzeitig zu messen (Abb. 4).

HTRF HTplex Assay zur Bestimmung von cAMP und IP1 gemessen im PHERAstar® FS Mikroplatten-Reader mit TR-FRET-Laser

Die gleichzeitige Messung zweier Signale bietet einen großen Zeit- und damit Kostenvorteil. Dieser Zeitgewinn kann weiter ausgebaut werden, wenn  ein Laser zur Anregung der Lanthanide eingesetzt wird. Der Mikroplatten-Reader-Hersteller BMG LABTECH bietet die Laser-gestützte Anregung von TRF-Proben an. Die dadurch bedingte sehr energiereiche Anregung bei einer einzelnen Wellenläge führt zu noch schnelleren und stabileren Messungen, da die Hintergrundsignale (Blankwerte) durch den Laser im Vergleich zu einer Blitzlampe abermals verringert werden. Die Lanthanide zeigen hervorragende spektrale Eigenschaften. Auf der anderen Seite ist ihre industrielle Gewinnung sehr kostenintensiv, da sie selten vorkommen.

Lumineszenz-basierte Detektion einer Rezeptor-Ligand-Bindung

Während für die Messung der Fluoreszenz immer eine Anregungsquelle nötig ist, wird bei der Lumineszenz nur die reine Emission der Probe gemessen. Dabei macht man sich Eigenschaften der Luziferase zunutze. Dieses Enzym reagiert auf die Zugabe von Substrat mit der Ausstrahlung von Licht. Die Luziferase kann an andere Proteine gekoppelt werden und dient als Reporter für die Aktivität des gekoppelten Proteins. Dieses Verhalten wird für die Detektion einer Liganden-Rezeptor-Bindung benutzt. Es gibt Luziferase-basierte Biosensoren, die die Konzentration von cAMP oder auch von Ca2+ in der Zelle anzeigen.

BRET (Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer)

Eine weitere etablierte Methode zur Bestimmung von Protein-Protein-Bindungen ist BRET. Hierfür wird eine Luziferase mit dem einen Protein und ein Fluoreszenzfarbstoff mit dem anderen Protein verbunden. Die Interaktion beider Proteine wird detektiert, nachdem ein Substrat für die Luziferase zugegeben wird. Die Luziferase reagiert mit der Aussendung von Licht, welches den Fluoreszenzfarbstoff am Bindungspartner anregt. Eine zweite Emission wird gemessen, wenn die Proteine interagieren – das BRET-Signal. Die BRET-Methode lässt sich auf verschiedene Art und Weise für die Detektion von Ligand-Rezeptor-Bindungen einsetzen:

  • BRET zwischen Rezeptor und Ligand
  • BRET zwischen Rezeptor und den G-Proteinen
  • BRET zwischen Rezeptor und nachgelagerten Effektoren, wie z.B. Adenylylcyclase
  • cAMP-BRET-Biosensoren

Die cAMP-BRET-Biosensoren geben bereits ohne Ligandenbindung das BRET-Signal. Bei der Bindung eines Liganden an den Rezeptor wird über die Signalkette cAMP angereichert. Dieses erreicht den Biosensor und ändert dessen innere Struktur, wodurch das BRET-Signal verringert wird. Das BRET-Signal ist abhängig von der ausgeschütteten cAMP-Konzentration, womit die Aufnahme von Dose-Response-Kurven möglich ist.

Neben der indirekten Methode kann BRET auch für den direkten Nachweis einer Ligand-Rezeptor-Interaktion eingesetzt werden. Dies gelang kürzlich Forschergruppen aus Australien und England, die in einem Verbundprojekt mit den Firmen Promega und BMG LABTECH zusammenarbeiten. Die Ergebnisse der Forschungsgruppe zeigen erstmals das Prinzip der Ligandenbindung an G-Protein gekoppelte Rezeptoren in lebenden Zellen in Echtzeit2. BRET hat sich auch dabei als echte Alternative zu Experimenten mit radioaktiv markierten Liganden erwiesen und den Forschern erweiterte Einblicke in zellulare Prozesse ermöglicht. Promega Corporation hat für die Forschung die neuesten Reagenzien beigesteuert, BMG LABTECH hat die Multifunktions-Mikroplatten-Reader CLARIOstar® und PHERAstar® FS für die BRET Messungen zur Verfügung gestellt. Für die Messungen wurde die  Nanoluziferase (NanoLuc®) an dem N-Terminus eines GPCRs exprimiert, während die Liganden mit Fluoreszenzfarbstoffen versehen sind. Auf diese Weise entsteht das BRET-Signal genau dann wenn der Ligand am Rezeptor bindet. Mithilfe dieser direkten BRET-Messungen konnte die spezifische Bindung von Liganden an verschiedene GPCRs (z.B. Adrenorezeptor oder Angiotensinrezeptor) in lebenden Zellen untersucht werden. 

Ligand-Rezeptor-Bindungsstudien mit der NanoLuc (a) bzw. der RLuc8 (b)2. Die Messungen wurden am PHERAstar® FS bzw. CLARIOstar® Mikroplatten-Reader von BMG LABTECH durchgeführt

Dabei stellte sich heraus, dass nicht jede Luziferase für die Messungen geeignet ist. Während Zellen, die die bekannte Renilla Luziferase (RLuc8) am N-Terminus des Rezeptors exprimiert hatten, keine spezifische Bindung zeigten, konnte eine Bindung nachgewiesen werden, wenn die Zellen mit einem NanoLuc-Konstrukt transfiziert waren (Abb.5).

Die Autoren führen die erfolgreiche Messung mit der NanoLuc darauf zurück, dass der Rezeptor zusammen mit der deutlich kleineren Luziferase vollständig an die Membran transportiert werden kann, während dies nicht für die Renilla-Konstrukte gelingt.

Anforderungen an Detektionssysteme

Automatisierung und Miniaturisierung stehen bei der Wirkstoffsuche im Vordergrund. Aus diesem Grund sollten Mikroplatten-Reader gewählt werden, die mit Hilfe von internen Pumpen Substrate injizieren können, simultan zwei Emissionen messen und sich leicht in Robotersysteme integrieren lassen. Auch von Vorteil ist eine leistungsstarke Auswertesoftware, die Datenanalyseverfahren verwendet, so dass die gewünschten Assayparameter, wie z.B. IC50- oder S/B-Werte automatisch angezeigt werden.


Referenzen

1Lundstrom K. (2009) An overview on GPCRs and drug discovery: structure-based drug design and strutural biology on GPCRs. Methods Mol Biol. 552:51-66.

2Stoddart et al. (2015) Application of BRET to monitor ligand binding to GPCRs. Nat. Methods 12(7): 661-663.

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