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Direkte Eubakterien-PCR-Diagnose von primär sterilen Körperflüssigkeiten und Geweben

Kultur-unabhängige molekulare Diagnose mikrobieller Infektionen

Dr. Michael Lustig
Molekularbiologe und Produktspezialist für Molekulare Diagnostik bei Molzym

Breitband-PCR-Diagnose von Erregern ohne Kultivierung

Die Kultivierung von klinischem Material ist standardisiertes Verfahren für die Diagnose von Infektionskrankheiten. Die Rate von nicht identi­fizierten Infektionen kann allerdings, in Abhängigkeit vom Probenmaterial, bemer­kenswert hoch sein [17]. Besonders gut untersucht ist die infektiöse Endokarditis, deren Blutkultur­negative Rate – bestimmt durch Serologie, Kul­tivierung anderer Proben und Mikroskopie – bei 12 % und damit nahezu doppelt so hoch liegen kann wie die Blutkulturpositive Rate [11]. Es sind hier überwiegend langsam wachsende bzw. nicht-kultivierbare Organismen, die für die hohe falsch-negative Rate der Kultur verantwortlich sind. Dazu zählen u. a. Coxiellen, Bartonellen, Chlamydien, Legionellen [5] und Tropheryma whippleii, die teils nur mit der PCR nachgewie­sen werden können [3]. Bei der Sepsis und ihren fortgeschrittenen Stadien liegt der Grund für Kulturnegative Fälle überwiegend in der Hem­mung der Erreger durch Verabreichung von Antibiotika vor der Blutentnahme [4]. Beispiele für Kulturnegative Infektionen sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Inzidenz Kulturnegativer Infektionen kann in einigen Erkrankungen wie infektiöse Aszites 2- bis 3-mal so hoch liegen wie die Rate der Infektionen in der Kultur.

Tabelle 1

Krankheit

Patien
-ten

Proben Fokus der Studie Kulturp-ositive Infektionen (%) a Kultur-negative Infektionen (%) b Methode Ref.
Akute osteo-artikuläre Infektion 390 Blut, Punktate, Gewebe MRSA-Rate 50,1 49,9 klinische Parameter [22]
Hirnabszess 1 Gewebe Mischinfektion - + Breitband 16S rRNA-Gen-PCR plus Sequenzierung [8]
  1 Gewebe Streptococcus intermediusInfektion - + Breitband 16S rRNA-Gen-PCR plus Sequenzierung [18]
Systemische Infektion 218 EDTA-Blut Infektionsrate 19,3 2,3 Gram-spezifische Real-Time PCR [1]
  233 Blutkultur Infektionsrate 54,9 4,7 Breitband 16S rRNA-Gen-PCR plus DNA-Array [12]
  384 EDTA-Blut MRSA-Rate 1,6 2,6 spezifische Real-Time PCR [21]
Infektiöse Aszites 130 Punktate bakterielle Infektion bei viralen zirrhotischen Patienten 28,5 71,5 klinische Parameter [9]
  187 Punktate bakterielle Infektion bei viralen zirrhotischen Patienten 23,5 76,4 klinische Parameter [7]
  100 Gewebe, Punktate Infektionsrate 9,9 2,0 Breitband 16S rRNA-Gen-PCR plus Pyro-Sequenzierung [2]
Infektiöse Endokarditis 516 Blut Infektionsrate 6,6 12,2 pathologisch, andere Kulturen, Serologie [11]
a nicht nach klinischer Relevanz gewichtete Ergebnisse unter allen Patienten
b klinisch relevante Ergebnisse unter allen Patienten

Als anerkanntes diagnostisches Verfahren wird die Breitband-16S-PCR mit Sequenzidenti­fizierung in vielen Laboratorien als ultima ratio Methode verwendet. PCR-Verfahren basieren auf dem Nachweis von Nukleinsäuren und sind deshalb nicht auf die Vermehrung von Mikroor­ganismen angewiesen. Dieser Vorteil wird ins­besondere beim Nachweis von Erregern gese­hen, die in der Kultur aus genannten Gründen nicht anwachsen (siehe Tabelle 1). Für die mo­lekulare Diagnose wird das klinische Material direkt untersucht. Die Erreger-DNA wird aus den Proben extrahiert und mittels PCR oder Real-Time PCR nachgewiesen. Bei der Breitband-Analyse werden die Erreger im Anschluss z. B. durch eine Sequenzanalyse genau identifiziert.

Direkte Diagnose mittels UMD-Universal

UMD-Universal ist ein für die in-vitro Diagnose (CE-IVD) zugelassener Breitband-16S/18S-rRNA-Gen-Test für Bakterien und Pilze, der mit Direktmate­rial durchgeführt wird: EDTA-Blut, Punktate von Gelenken und Flüssigkeitsansammlungen des Bauchraums, Abszesse, verschiedene Gewebe (Haut-, Organ-, Knochen-Biopsien), Abstriche von Wunden und Kathetern und anderes Mate­rial. Die Proben werden mittels Kit-eigener Pro­tokolle für die Anreicherung und Reinigung mikrobieller DNA aus den verschiedenen Mate­rialien verarbeitet und in der Real-Time-PCR analysiert. Das kann manuell wie auch automa­tisiert erfolgen. Positive Proben gehen in die Sequenzanalyse des Amplifikati­onsproduktes: ein BLAST-Algorithmus mit Qua­litätsgeprüfter, frei zugänglicher Datenbank (sepsitest-blast.de) von über 7.000 Einträgen der 16S und 18S rRNA-Gene von Bakterien bzw. Pilzen führt zur Identifizierung des Erre­gers. Mischinfektionen aus bis zu sechs Erregern können durch die Se­quenziermethode und unter zu Hilfenahme eines speziellen Algorithmus (Ripseq®, Isentio, Oslo) aufgelöst und bestimmt werden.

Tabelle 2

Primäre Diagnose Material Patienten Kulturpositive Infektionen (%) a Kulturnegative Infektionen (%) b Ref.
Diverse Synovialflüssigkeit, Gewebe, Liquor, Peritonalflüssigkeit 84 25,0 15,5 [4]
  Herzklappen, Synovialflüssigkeit, Liquor, Blut, Blutkultur 66 18,2 21,2 [14]
  Blut 120 13,3 18,3 [6]
Infektiöse Endokarditis Blut und Herzklappen 29 31,0 48,3 [10]
 

Katheterspitze mit Corynebacterium striatum

1 - c + [16]
Meningitis Liquor 12 - c 50,0 [13]
Sepsis Blut 187 18,2 13,4 [20]
  Blut 26 30,8 7,7 [15]
Zeckenstich-Infektion Blut
Neoehrlichia mikurensis
2 - c + [19]
a Kultivierung der Proben in Blutkulturflaschen; nicht nach klinischer Relevanz gewichtete Ergebnisse unter allen Patienten
b PCR-positive, Kulturnegative, klinisch relevante Ergebnisse unter allen Patienten
c Kulturnegative Patienten

UMD-Universal wurde bislang mit diversen Pro­ben von über 500 Patienten in Studien auf die diagnostischen Eigenschaften untersucht. Eine multizentrische, internationale Studie zur Sep­sisdiagnostik unter Einbeziehung von mehr als 200 Patienten wurde gerade abgeschlossen. Die diagnostischen Werte von UMD-Universal gegen­über der Blutkultur waren zufrieden stellend (80-88,5 % Sensitivi­tät [4, 6, 10, 20]). Als besonders hilfreich er­wies sich UMD-Universal für die Diag­nose Kultur­negativer Infektionen bei diversen Erkrankun­gen, deren Rate der in der Kultur be­stimmten Infektionen entsprach bzw. überstieg (Tabelle 2). Damit stellt UMD-Universal ein nützli­ches In­strument als Ergänzung der Blutkultur dar.

Labor-Service

Molzym bietet einen speziellen Identifikations-service für die Kulturunabhängige Diagnose von Erre­gern mit UMD-Universal an. Diverse Probenmateri­alien werden direkt analysiert. Je nach Probenzahl erfolgt die Analyse innerhalb von 1-3 Wochen. Die Ergebnisse werden als Be­richte übermit­telt. Bitte informieren Sie sich nä­her über den Service.

Referenzen

[1]  Chan KYY, Lam HS, Cheung HM et al. (2009) Crit Care Med 37: 2441-2447.

[2]  Gadsby NJ, Onen A, Phillips SA et al. (2011) Open J Med Microbiol 1 (doi:10.4236/ojmm.2011.11001).

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[6]  Irwin AD, Carrol ED, Barton T et al. (2012) Poster P1797, 22nd ECCMID, London.

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[12]Matsuda K, Iwaki KK, Garcia-Gomez J et al. (2011) J Clin Microbiol 49: 2031–2034.

[13]Meyer T, Polywka SKA (2011) Poster 1103, 111th ASM Meeting, New Orleans.

[14]Nolte O, Locher F, Haag H (2011) Poster P1735. 21st ECCMID, Milan.

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[19]von Loewenich FD, Geiß-dörfer W, Disqué C et al. (2010) J Clin Microbiol 48: 2630-2635.

[20]Wellinghausen N, Kochem AJ, Disqué C et al. (2009) J Clin Microbiol 47: 2759-2765.

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[22]Williams DJ, Deis JN, Tardy J et al. (2010) Ped Infect Dis J 30: 523-525.

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