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Effiziente und robuste Verfahren für die Aufreinigung von Biopharmazeutika

Regina Römling und Egbert Müller, Tosoh Bioscience

Moderne Chromatographieharze auf Polymerbasis können durch ihre hohe mechanische und chemische Stabilität und gesteigerte Proteinbindekapazitäten sowohl Durchsatz als auch Robustheit biopharmazeutischer Herstellungsprozesse steigern.

Fortschritte in Gentechnik und Zellkultur-Technologie haben die Expressionsraten rekombinanter Proteine und damit die Produktivität des Herstellungs- oder Upstream- Prozesses enorm gesteigert. Titer von bis zu 10 g/l erfordern hocheffiziente und robuste Aufreinigungsoder Downstream Prozesse (DSP). In der industriellen Bioverfahrenstechnik werden üblicherweise universelle DSP-Plattformen zum Aufreinigen verschiedener Kandidaten derselben Proteinklasse eingesetzt (1). Neben verschiedenen Filtrations- und Virusinaktivierungs- Schritten bestehen sie aus zwei bis drei chromatographischen Schritten in denen orthogonale Trennungsmodi eingesetzt werden. Der Einsatz von Hochleistungs- Chromatographieharzen kann den Durchsatz und die Robustheit der Prozesse steigern und so den DSPEngpass überwinden helfen. Ohne die vorhandenen Säulen und andere Hardware zu wechseln, können größere Probenmengen geladen und schnellere Flussraten eingesetzt werden.

Zur Etablierung von robusten und effizienten industriellen biopharmazeutischen Herstellungsprozessen müssen während der Prozessentwicklung die optimalen Bedingungen für den Betrieb jedes Prozessschrittes ermittelt werden. Heute unterstützen statistische Versuchsplanung (Design of Experiments/DoE) und robotergestützte Screeningverfahren (high throughput screening/HTS) das effiziente Screening der Chromatographieharze und Methodenparameter. Die Anwendung dieser Technologien trägt außerdem zu einem besseren Prozessverständnis und damit der Bestimmung des sogenannten design space bei, eine der Voraussetzungen für einen Quality by Design (QbD) Ansatz in der Entwicklung von robusten und validierten Plattformen.

AUFREINIGUNG MONOKLONALER ANTIKÖRPER

Monoklonale Antikörper (mAbs) stellen den Bereich mit dem größten Wachstum in der biopharmazeutischen Industrie dar. Zur großtechnischen Aufreinigung von Antikörpern werden verschiedene präparative Chromatographiemodi eingesetzt. Die meisten Antikörper-Plattformen setzen die Protein A-Affinitäts- Chromatographie im Capture-Schritt ein. Dabei nutzt man die spezifischen Wechselwirkungen zwischen den Fc-Regionen der Immunglobuline und immobilisiertem Protein A, einer Zellwandkomponente aus Staphylococcus aureus. Moderne Protein A-Affinitätsharze tragen meist rekombinante Protein A-Liganden. Die Protein A-Affinitäts- Chromatographie ist gut etabliert und hochspezifisch für Immunglobuline. In einem Protein A-Capture-Schritt kann üblicherweise eine Reinheit von über 95 Prozent erzielt werden. Um die höhere pharmazeutisch benötigte Reinheit zu erzielen, wird in der Regel die Protein A-Affintiätschromatographie in einem dreistufigen Verfahren mit anderen Chromatographiemodi – wie Kationenaustausch, Anionenaustausch oder hydrophober Interaktion (HIC) kombiniert.

Alternative Konzepte legen den Schwerpunkt entweder auf das Verringern der Anzahl chromatographischer Prozessschritte zu einem zweistufigen Verfahren oder auf die Entwicklung von Plattformen ohne Protein A. Die Eliminierung des Protein A-Schritts würde die bekannten Nachteile der Protein A-Chromatographie wie hohe Kosten, Ausbluten des Protein A Liganden und die Bildung von Aggregaten aufgrund der zur Elution erforderlichen sauren Bedingungen überwinden. So haben Lain et al. den Einsatz von Kationenaustausch- Chromatographie als Ersatz für den Protein A-Schritt als mAb-Capture-Schritt vorgestellt (2). Sie entwickelten einen Hochleistungs-Capture-Schritt für Antikörper auf der Basis von Toyopearl GigaCap S-650M.

Im Jahr 2009 veröffentlichte die CMC Biotech- Arbeitsgruppe die „A-MAb-Fallstudie“, eine Zusammenfassung der gemeinsamen Bemühungen mehrerer großer Biopharmaka-Hersteller, am Beispiel eines monoklonalen Antikörpers einen QbD-Ansatzes für die gesamte Produktentwicklung darzustellen (3). A-Mab – ein humanisierter IgG1 monoklonaler Antikörper – wurde eingesetzt, um typische Gruppen oder Sequenzen von Aufgaben in der Entwicklung eines monoklonalen Antikörpers zu definieren, einschließlich des Upstreamund Downstream-Prozesses.

HARZE FÜR DIE PROZESSCHROMATOGRAPHIE

Zur industriellen Aufreinigung von rekombinanten Antikörpern kann eine breite Palette von kommerziellen Chromatographieharzen eingesetzt werden. Die Basismaterialien reichen von relativ weichen Matrizes auf Agarosebasis bis zu Matrizes aus porösem Glas über härtere Polymeren bis zu Kieselgel. Oft werden Harze verschiedener Lieferanten kombiniert, um die maximale Leistung für jeden einzelnen Schritt zu erreichen. Neben Bindekapazität, Reinheit, Robustheit gegenüber Sanitisierung und Reinigung vor Ort (Cleaning in place/ CIP), sollten bei der Wahl der Chromatographieharze für einen spezifischen Schritt auch die mechanischen Eigenschaften der Harze beachtet werden. Die Härte des Harzes beeinflusst sowohl das Säulenpacken als auch die Bettstabilität großtechnischer Industriesäulen bei hohen Flussgeschwindigkeiten.

Toyopearl® Harze basieren auf einem vernetzten, relativ harten Polymethacrylat-Partikel. Die hohe mechanische Stabilität führt zu ausgezeichneten Druck-Fluss- Eigenschaften und unkompliziertem Säulenpacken. Mit der Einführung des ersten Protein A-Prozessharz auf der Basis von Toyopearl Partikeln – Toyopearl AF-rProtein A-650F, kann nun eine komplette mAb-Aufreinigungsplattform auf der Basis von Toyopearl etabliert werden.

EVALUIERUNG DER REINIGUNGSSCHRITTE

Ein generischer mAb-Prozess setzt voraus, dass die vordefinierte Plattform für eine Vielzahl von Antikörpern eingesetzt werden kann. Allerdings erfordern die physikalisch- chemischen Unterschiede der mAbs einen flexiblen Plattformansatz. Das allgemeine Schema des Downstream-Prozesses und die Grenzen der Methodenparameter können vordefiniert werden, aber einzelne Bedingungen müssen gezielt auf den speziellen Antikörper abgestimmt werden. HTS und DoE sind leistungsstarke Werkzeuge bei der Festlegung des sogenannten Design Space des Aufreinigungs-Prozesses. Ausgehend von den Ergebnissen der CMC-Studie wurde begonnen, eine mAb-Aufreinigungsplattform zu entwickeln, die komplett auf hochleistungsfähigen Polymerharzen basiert. HTS-Techniken und die DoEMethodik wurden zur Evaluierung der einzelnen chromatographischen Schritte eingesetzt. Verschiedene Harze und Verfahrensparameter für den Protein A-Affinitätsschritt und anschließende Ionenaustauschschritte wurden bewertet. Roboterplattformen für parallele Chromatographie erleichtern das Screening von Chromatographieharzen erheblich und unterstützen eine schnelle Optimierung der Verfahrensparameter (4); sie prozessieren kleine Screening-Säulen im Mikrotiterplatten-Format in wenigen Stunden. Heute ergänzen oder ersetzen solche Hochdurchsatzsysteme das mühsame und probenintensive Screening auf Säulenbasis in vielen industriellen Prozessentwicklungsabteilungen.

Abbildung 1: Durchbruchskurven für hIgG-Beladung (polyklonal, 10 mg/ml) Typische DBC bei 10% Durchbruch: 33 mg/ml @ 60 cm/Std. (5 Min. Verweilzeit) - 24 mg/ml @ 200 cm/Std. (1,5 Min. Verweilzeit) Säule: 5 mm ID x 5 cm L Mobile Phase: 20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,2, 150 mM NaCl Probenkonz.: 10 mg/ml Verweilzeit: 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 4,0, 5,0 Min.

PROTEIN A-AFFINITÄT

Toyopearl AF-rProtein A-650F bietet einige Vorteile für die Effizienzsteigerung eines auf Protein A basierenden mAb-Capture-Schritts. Es besitzt eine hohe dynamische Bindekapazität für IgG auch bei hohen Flussraten und bei Beladung mit hochkonzentrierten Ausgangsstoffen (siehe Abbildung 1). Sein rekombinanter Ligand, der aus einer Untereinheit des Protein A entwickelt wurde, ist nicht nur durch eine, sondern durch mehrere stabile Bindungen an die Polymermatrix gebunden. Dies führt zu geringerem Liganden-Bluten und hoher Stabilität gegenüber alkalischen CIPBedingungen. Verschiedene Protein A Affinitätsgele, Toyopearl AF-rProtein A-650F eingeschlossen, wurden in MediaScout® MiniSäulen (Atoll GmbH, Weingarten) unter Variation von Bindepuffer-pH-Wert, Beladung und Verweilzeit getestet.

HCP ENTFERNUNG
Bettvolumen
(μl)
Proteinladung
(mg/ml gel)
pH Flussrate
(cm/h)
HCP
(ppm)
Toyopearl AF-rProtein A 200 5 3.9 100 19.2
rProtein A resin auf Agarose Basis 200 5 3.9 100 59.7
Toyopearl AF-rProtein A 200 5 3.9 250 9.8
rProtein A resin auf Agarose Basis 200 5 3.9 250 30.5
Toyopearl AF-rProtein A 200 25 3.9 250 47.3
rProtein A resin auf Agarose Basis 200 25 3.9 250 629.6
Tabelle 1
Auswirkung der Verweilzeit auf die CHO-Wirtszellprotein- (HCP) Entfernung für zwei alkalistabile rProtein A-Harze: Toyopearl AF-rProtein A-650F und ein rProtein A Harz auf Agarosebasis. HCP-Gehalt bestimmt durch ELISA (Cygnus Technologies). Daten mit freundlicher Genehmigung von U. Breuninger, Universität für angewandte Wissenschaft Esslingen.

Zur Simulation einer realen Probe wurde ein CHOZellkulturlysat mit reinem monoklonalen Antikörper (IgG1) versetzt. Reinheit und Wiederfindung des Antikörpers im Eluat wurden bestimmt. Die Reinheit der Antikörperfraktion wurde mit Hilfe von Immunassays für die CHO-Zellproteine (host cell proteins/ HCP) und für das abgelöste Protein A bestimmt. Tabelle 1 zeigt die HCP-Verringerung bei Veränderung der Probenladung und/oder Flussrate (Verweilzeit) bei festgelegtem Bettvolumen und pH-Wert. Mit Toyopearl AF-rProtein A-650F aufgereinigte Fraktionen zeigten unter allen getesteten Bedingungen eine geringere Menge an verbliebenen CHO-Proteinen im Vergleich zu denen, die mit einem anderen gängigen rProtein A-Gel mit vergleichbarer IgG-Bindekapazität erhalten wurden.

Data kindly provided by U Breuninger at the University of Applied Science, Esslingen, Germany

Abbildung 2: Einfluss des pH-Werts des Bindepuffers und der Ionenstärke des Elutionspuffers auf den CHO-Proteingehalt der mAb-Fraktion, nach Reinigung durch Kationenaustausch-Chromatographie auf Toyopearl GigaCap CM-650M.

IONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE

Die Verringerung der CHO-Proteine (CHOP) wurde auch für einen Kationenaustauscher-Schritt in einem DoE-Ansatz unter Veränderung der Parameter Proteinladung und pHWert sowie Ionenstärke von Binde- und/oder Elutionspuffer bewertet. Bei niedrigem pH-Wert des Bindepuffers hat die Ionenstärke des Elutionspuffers (dargestellt als Leitfähigkeit) keinen signifikanten Einfluss auf die Menge des vom Kationenaustauscher (Toyopearl GigaCap CM-650M, siehe Abbildung 2) eluierenden verbliebenen HCP. Mit zunehmendem pH-Wert des Bindepuffers bis zu neutralen pHWerten ist ein wachsender Einfluss der Ionenstärke auf das Entfernen von HCP zu beobachten. Ähnliche Screening- Experimente wurden für Anionenaustausch- und hydrophobe Interaktions-Chromatograpphie (Daten nicht abgebildet) durchgeführt. Durch Anwendung der idealen Bedingungen in jedem Verfahrensschritt können unterschiedliche DSP Plattform-Strategien gut im Labormaßstab simuliert werden.

Abbildung 3: Druck-Fluss-Charakteristika von Prozessharzen auf Polymethacrylat- Basis. Harte, polymerische Prozessharze können bei hohen Flussraten eingesetzt werden. Toyopearl GigaCap S-650M Kationenaustauschharz mit mittlerer Partikelgröße von 75 μm (grau), sowie Toyopearl AF-rProtein A-650F (rot) mit mittlerer Partikelgröße von 45 μm können bei linearen Geschwindigkeiten von mehr als 1.000 cm/Std. eingesetzt werden.

DSP-DURCHSATZ STEIGERN

Künftige Herausforderungen der industriellen Antikörperreinigung werden in weiter steigenden Zellkulturtitern liegen. Viele etablierte chromatographische Verfahren stoßen so an ihre Grenzen im Hinblick auf den Durchsatz, den sie bieten können. Die Möglichkeit, chromatographische Aufreinigungsschritte mit einer großen Bandbreite an Fließgeschwindigkeiten und Proteinbeladungen durchzuführen, erweitert den Anwendungsbereich, den eine validierte Aufreinigungsplattform bietet. Der Einsatz von Harzen mit hoher mechanischer Stabilität und hoher Proteinbindekapazität unterstützt diese Anforderungen.

Literatur

  1. Shukla et al, J Chromatogr B 848: pp28-39, 2007
  2. Lain et al, Bioprocess International 7.5: pp26-34, 2009
  3. A-mab: A Case Study in Bioprocess Development, CMC Biotech Working Group, Version 2.1, October 2009
  4. Bensch et al, Chemical Engineering & Techn 28(11): pp1,274-1,284, 2005

Regina Römling ist als Marketing-Manager bei Tosoh Bioscience GmbH zuständig für die Tosoh Chromatographieprodukte wie HPLC-Säulen und Prozessmedien. Vor ihrem Wechsel zu Tosoh im Jahr 2007 war sie Produktspezialist für HPLC-Systeme bei Shimadzu. Im Jahr 1990 absolvierte sie ihren Hochschulabschluss in Chemie, Fachrichtung Biochemie, an der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster. Ihr Hintergrund umfasst 5 Jahre Forschungstätigkeit im Bereich Molekularbiologie und Gentechnik an der Universitätsklinik Münster und 15 Jahre Berufspraxis im Bereich Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie.

Egbert Müller ist Technischer Direktor bei Tosoh Bioscience GmbH. Nach der Promotion in theoretischer Chemie hat er sich auf dem Gebiet der Biochromatographie habilitiert. Er ist Dozent für industrielle Biotechnologie an der Universität Darmstadt und Gruppenleiter bei Forschungsförderungsprojekten, die vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) finanziert werden. Egbert Müller gehört dem wissenschaftlichen Komitee des Internationalen Symposiums für Trennung von Proteinen, Peptiden und Polynukleotiden (ISPPP) an und ist Mitglied der Gesellschaft für Affinität und molekulare Erkennung. Er besitzt mehr als 30 Patente für Oberflächenmodifizierungs-Technologie von Chromatographieharzen.

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