Meine Merkliste
my.bionity.com  
Login  

Partikel mit Potenzial: Mizellen und Liposomen - charakterisiert mit dem Eclipse AF4-System und dem DAWN HELEOS II Mehrwinkel-Lichtstreu-Detektor

Nanostrukturen im Visier der Forschung
Mizellen sind runde Nanostrukturen, Sie bestehen aus amphiphilen Molekülen, weisen also lipophile und hydrophile Bereiche auf und sind dadurch sowohl in polaren (Wasser) als auch unpolaren,organischen Lösungsmitteln löslich. Mizellen (oder auch Assoziationskolloide) sind einschichtig und haben einen Durchmesser von 10 bis 30 nm.
Man kann sie einsetzen, um in ihrem Inneren bioaktive Substanzen unterzubringen und geschützt an den gewünschten Wirkungsort zu transportieren. Dieses Vorgehen könnte beispielsweise die Nebenwirkungen reduzieren, die bei systemischer Verabreichung von Medikamenten erfahrungsgemäß immer wieder auftreten. Bereits seit einiger Zeit gibt es Erfahrungen mit dem Einsatz von Vitaminen und Enzymen, die in Mizellen „verpackt“ als Lebensmittelzusatzstoffe eingesetzt wurden.
Mizellen, die man als Transportvehikel benutzen möchte, sollten idealerweise eine enge Größenverteilung aufweisen. Sie müssen zudem stabil sein und ihre Inhaltsstoffe möglichst nur in der vorbestimmten Zielregion frei setzen.
Um diese Eigenschaften sicher zu stellen, muss man Mizellenpräparate zuverlässig charakterisieren und ihre Größenverteilung sowie ihre Molmassen mit hoher Genauigkeit bestimmen können. Anhand dieser Daten kann man ermitteln, in welchem Umfang die Mizellen tatsächlich bioaktive Komponenten aufgenommen haben.
Solche anspruchsvollen analytischen Ziele lassen sich nur mithilfe der fortschrittlichsten Systeme am Markt anvisieren. So muss man zum Beispiel in der Lage sein, das Gemisch aus Mizellen unterschiedlicher Größe mit einem schonenden Verfahren aufzutrennen, damit die empfindlichen Partikel in ihrer ursprünglichen Form erhalten bleiben und nicht zerstört werden. Dies ist mit herkömmlichen Verfahren wie der Größenausschlusschromatographie (SEC: size exclusion chromatography) kaum zu bewerkstelligen, weil die dabei auftretenden Scherkräfte den Strukturen schaden würden. In diesem Falle ist die asymmetrische Feldflussfraktionierung (AFFFF oder AF4) die Methode der Wahl.

Das Trennprinzip
Zentrales Element aller AF4-Techniken ist der sogenannte Kanal, welcher bei der HPLC der Trennsäule entspricht. Dieser Kanal ist so konstruiert, dass die Elutionsflüssigkeit darin eine laminare Strömung ausbildet, den Kanalfluss (channel flow), der in der Mitte schneller strömt als an seinem Rand. Senkrecht zum Kanalfluss wird ein Querfluss (cross flow) angelegt, der die eigentliche Trennkraft auf die Moleküle ausübt. Den Bereich, in dem der Querfluss seine Wirkung entfaltet, bezeichnet man auch als Trennfeld (siehe Abbildung 1). Befinden sich Analyten im Kanal, so wirkt das Trennfeld auf die Probenbestandteile ein und drückt diese in Richtung der unteren Kanalbegrenzung (Akkumulationswand), die als Fritte konstruiert ist, auf der eine Membran mit definierter Porengröße liegt. Aufgrund der Brownschen Molekülbewegung und ihres hohen Diffusionskoeffizienten diffundieren kleinere Partikel weiter von der Akkumulationswand weg in den Kanal hinein als größere, weniger bewegliche Partikel. Durch die beiden entgegengerichteten Kräfte (Querflusskraft und Diffusionskraft der Moleküle) bildet sich ein dynamisches Gleichgewicht aus (Abbildung1).

Abb. 1: Allgemeines Trennprinzip der AF4 (siehe Text)


Dies resultiert in einer definierten Verteilung der Partikelwolken im Kanal. Partikelwolken von kleinen Teilchen haben dabei im zeitlichen Mittel einen größeren Gleichgewichtsabstand von der Akkumulationswand als Partikelwolken größerer Teilchen (Abbildung 1). Folglich befinden sich kleine Partikel im Bereich von schnellen Strömungslinien und werden deshalb früher als große Partikel aus dem Kanal eluiert. Bezogen auf die Teilchengröße ist die Reihenfolge der Elution also umgekehrt zu der einer SEC-Methode. Der potenzielle Trennbereich dieser Technologie umfasst dabei Analyten in einer Größenordnung von etwa 1 nm bis hin zu mehreren µm.

Abb. 2: Schema einer Mizelle. Hydrophile Köpfe und hydrophobe Schwänze der Moleküle arrangieren sich so, dass im Inneren der Mizelle eine lipophile Höhlung entsteht.


Charakterisierung von Mizellen
Das fortschrittlichste AF4-System, die Wyatt Eclipse, trennt mizellare Strukturen hoch auflösend und zerstörungsfrei nach ihrer Größe. Direkt im Anschluss daran übernimmt ein Dawn HELEOS Mehrwinkel-Lichtstreu-detektor (MALS) die Messung der absoluten Molmasse dieser Partikel mit höchster Präzision. So lässt sich jede der gewonnenen Partikelfraktionen in Bezug auf Radius und Molmasse exakt charakterisieren. Dies ermöglicht genaue und verlässliche Aussagen über die Qualität der untersuchten Mizellenpräparation. In dieser Abhandlung zeigen wir, wie man aus der Summe gewonnener Daten wertvolle Informationen ziehen kann.

Abb. 3: Synopse dreier Chromatogramme von Mizellen-Präparationen, die mit unterschiedlichen aktiven Verbindungen beladen wurden. Dargestellt ist das Lichtstreusignal beim Winkel 90°. Oben: Trägheitsradius (rms) in nm, unten: molare Masse in g/mol.

Abb. 3: Synopse dreier Chromatogramme von Mizellen-Präparationen, die mit unterschiedlichen aktiven Verbindungen beladen wurden. Dargestellt ist das Lichtstreusignal beim Winkel 90°. Oben: Trägheitsradius (rms) in nm, unten: molare Masse in g/mol.

Abbildung 3 zeigt die Messdaten aus drei verschiedenen Mizellenpräparationen, die mit unterschiedlichen aktiven Verbindungen beladen wurden. Aus dem 90°-Lichtstreusignal wird klar ersichtlich, dass auch drei distinkte, in sich relativ einheitliche Fraktionen von Mizellen entstanden sind. Die drei Proben unterscheiden sich allerdings sowohl im Molekülradius (rms, root mean square radius, mittlerer Trägheits-Radius) als auch im Hinblick auf ihre molare Masse. Wie man ablesen kann, liegt der maximale Durchmesser der Partikel nicht über 20 nm und damit in einem für den Anwendungszweck optimalen Bereich.

Abb. 4: Vergleich zweier Mizellen-Präparationen, die mit der gleichen Verbindung gefüllt sind. Ein Präparat erscheint bimodal (rote Linie), das zweite dagegen unimodal mit einem breiten peak (blaue Linie). Dargestellt sind der rms-Radius gegen die Elutionszeit. sowie das UV-Signal.

Gleichartige Mizellenpräparationen können sich in ihrer Qualität deutlich unterscheiden, wie in Abbildung 4 gezeigt wird. Das blau dargestellte Präparat ist wie beabsichtigt unimodal, das heißt, es besteht aus nur einer Fraktion einheitlich großer Partikel, wenngleich der dazugehörige peak recht breit erscheint. Die rot dargestellte Probe hingegen ist bimodal. Dies bedeutet, dass zwei Gruppen von Mizellen mit unterschiedlicher Größe gebildet wurden, wie man am doppelten peak und an den beiden distinkten Plateaus des Lichtstreusignals ablesen kann. Die Mizellenpräparation ist in diesem Falle nicht optimal gelungen. Wie man sieht lässt sich lässt sich die Qualität der Präparate mittels AF4 und MALS hoch präzise untersuchen. Daher kann diese Analysemethode auch im Hinblick auf die Qualitätskontrolle wertvolle Dienste leisten.

Abbildung 5: Liposom: die membranöse Phospholipid-Doppelschicht aggregiert zu einer kugelförmigen Struktur.

Messung von Liposomen
Auch Liposomen stehen zunehmend im Fokus, wenn es um den gezielten Transport von pharmazeutischen und anderen Wirkstoffen geht. Unter einem Liposom versteht man kugelförmige, zweischichtige Aggregate oberflächenaktiver Moleküle in einer Flüssigkeit. Oftmals handelt es sich um Phospholipide wie etwa Lecithin in wässriger Suspension. Sie werden in ihrer Kugelform gehalten, indem sich die hydrophilen Teile nach außen, also zum wässrigen Milieu hin orientieren, während der lipophile Rest eine membranöse Struktur ausbildet (siehe Abbildung 5). Liposomen besitzen typischerweise eine Größe von 20-100 nm, können aber auch einige Mikrometer Durchmesser aufweisen.

Abbildung 5: Liposom: die membranöse Phospholipid-Doppelschicht aggregiert zu einer kugelförmigen Struktur.

Liposomen sind ideale Kandidaten für den Wirkstofftransport, besitzen sie doch im Inneren eine hydrophile Höhlung (Kavität), in der geeignete Moleküle gut geschützt nahezu überall hin verbracht werden können. Auch hier gilt allerdings: je besser man die Transportvehikel charakterisieren und ihre Qualität kontrollieren kann, desto verlässlicher und sicherer werden sie. Sowohl die homogene Verteilung hinsichtlich der Partikelgröße als auch die Effektivität, mit der die Liposomen befüllt wurden, sind gerade für die Anwendung am Menschen von ausschlaggebender Bedeutung, denn sie entscheiden über wichtige Parameter wie etwa Wirksamkeit, Verträglichkeit, mögliche Antigeneigenschaften, Toxizität und vieles mehr. So können Liposomen, die zu klein sind, nicht genügend Wirkstoff aufnehmen. Übergroße Partikel hingegen verursachen Komplikationen im Zuge der Injektion. Daraus ergibt sich, dass der hoch auflösenden Analyse der Größenverteilung solcher Liposomen entscheidende Bedeutung zukommt.

Abbildung 6: Mittels AF4 und MALS lassen sich gefüllte von leeren Liposomen unterscheiden.


Mithilfe der Eclipse-AF4 und daran gekoppelter MALS-Messung lässt sich – wie im Folgenden gezeigt – die Qualität von Liposomen sehr gut überprüfen. Abbildung 6 zeigt einen Vergleich zwischen gefüllten und ungefüllten Liposomen. Aus den Daten über Molmasse und Trägheitsradius kann man Aussagen darüber ableiten, ob die gemessenen Partikel leer oder gefüllt sind und darüber hinaus Aussagen darüber treffen, welcher Prozentsatz der Liposomen durch die jeweilige Präparationsmethode adäquat mit Wirkstoff versehen wurde. Die unbeladenen Liposomen zeigen einen schmaleren peak, sind also enger verteilt. Sie besitzen einen deutlich größeren Trägheitsradius (rms) als die gefüllten.

Abbildung 7: Vergleich zweier Liposomenpräparate mit enger (blau) und breiter (rot) Größenverteilung.

Um Liposomen mit einer engen Größenverteilung zu erhalten, muss man darauf achten, dass der Lecithingehalt der Präparation ausreichend hoch ist. Abbildung 7 zeigt den Vergleich zweier Ansätze. Blau dargestellt ist ein Präparat, das mit einem hohen Lecithinanteil hergestellt wurde. Es erfüllt die Anforderungen, die man im Hinblick auf die Partikelgröße stellt. Die rot dargestellte Probe hingegen enthält nur etwa 25% Lecithin niedriger Qualität. Anhand des Lichtstreusignals erkennt man eine sehr breite Größenverteilung, die Partikelgrößen außerhalb des optimalen Bereiches enthält. Eine solche Präparation wäre für den pharmakologischen Einsatz nicht geeignet.

 

Zusammenfassung
Liposomen und Mizellen erfahren als Wirkstoffträger in Pharmakologie und Kosmetik eine wachsende Verbreitung. Entsprechend wandeln sich die Anforderungen an die begleitende Analytik und die Qualitätskontrolle. So ist es unerlässlich, die Präparate in ihre Komponenten aufzutrennen und eingehend zu charakterisieren. Konventionelle Techniken wie etwa die Größenausschluss-chromatographie können diese komplexen Aufgaben nicht adäquat bewältigen. Hier beginnt das Einsatzgebiet der AF4 – Partikeltrennung mithilfe der Wyatt Eclipse. Gekoppelt an Mehrwinkel-Lichtstreugeräte wie etwa den Wyatt DAWN HELEOS ermöglicht diese high-end Gerätekonfiguration eine Partikelcharakterisierung mit unerreicht hoher Auflösung und Präzision, die überdies in puncto Zuverlässigkeit und Anwenderfreundlichkeit ihresgleichen sucht.

Abbildung 8:
Wyatt Eclipse 3+ - Partikeltrennsystem mit DAWN HELEOS II Lichtstreu-Detektor sowie Optilab rEX Refraktometer – optimale Konfiguration für die state-of-the-art Partikelcharakterisierung.

Fakten, Hintergründe, Dossiers
Mehr über Wyatt Technology
Ihr Bowser ist nicht aktuell. Microsoft Internet Explorer 6.0 unterstützt einige Funktionen auf Chemie.DE nicht.