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Weniger Fehler bei der Gen-Editierung mit CRIPSR

Biochemiker entdecken Ursache für Fehlschläge bei der Genombearbeitung

13.07.2018

Ryan Clarke, et al

UIC-Forscher zeigen, dass die persistente Cas9-Bindung an einen Doppelstrangbruch dazu führt, dass die CRISPR-Genombearbeitung in etwa 15 Prozent der Fälle fehlschlägt. Wenn RNA-Polymerasen mit Cas9 aus einer Richtung kollidieren (Template-Orientierung), können sie Cas9 ablösen und die Effizienz der Genombearbeitung erhöhen.

Forscher der University of Illinois in Chicago sind die ersten, die beschreiben, warum die Gen-Editierung mit CRISPR manchmal nicht funktioniert und wie der Prozess wesentlich effizienter gestaltet werden kann.

CRISPR ist ein Gen-Editierwerkzeug, mit dem Wissenschaftler unerwünschte Gene oder genetisches Material aus der DNA herausschneiden und manchmal eine gewünschte Sequenz oder Gene hinzufügen können. CRISPR verwendet ein Enzym namens Cas9, das wie eine Schere wirkt, um unerwünschte DNA herauszuschneiden. Sobald auf beiden Seiten der zu entfernenden DNA Schnitte gemacht werden, beginnt die Zelle entweder mit der Reparatur, um die beiden Enden des DNA-Strangs wieder zusammenzukleben, oder die Zelle stirbt ab.

In einer Studie zeigten die Forscher, dass wenn die Genbearbeitung mit CRISPR fehlschlägt, was in etwa 15 Prozent der Fälle auf eine persistente Bindung des Cas9-Proteins an die DNA an der Schnittstelle zurückzuführen ist, die die DNA-Reparaturenzyme daran hindert, auf den Schnitt zuzugreifen.

Senior Autor Bradley Merrill, Associate Professor für Biochemie und Molekulargenetik am UIC College of Medicine, sagt, dass die Forscher bisher nicht wussten, warum der Prozess zufällig scheiterte.

"Wir fanden heraus, dass es an Stellen, an denen Cas9 ein 'Blindgänger' war, an den DNA-Strang gebunden blieb und die Zelle daran hinderte, den Reparaturprozess einzuleiten", sagte Merrill. Das festgefahrene Cas9 ist auch nicht in der Lage, weitere Einschnitte in der DNA vorzunehmen, wodurch die Effizienz von CRISPR eingeschränkt wird, sagte er.

Merrill, UIC-Absolvent Ryan Clarke und ihre Kollegen fanden auch heraus, dass Cas9 wahrscheinlich an Stellen im Genom, an denen RNA-Polymerasen - Enzyme, die an der Genaktivität beteiligt sind - nicht aktiv sind, unwirksam ist. Weitere Untersuchungen ergaben, dass das Führen von Cas9 zu nur einem der Stränge der DNA-Doppelhelix die Interaktion zwischen Cas9 und der RNA-Polymerase förderte und dazu beitrug, ein " Blindgänger " Cas9 in einen effizienten Genom-Editor zu verwandeln.

Konkret fanden sie heraus, dass eine konsequente Strangselektion für Cas9 während der Genombearbeitung die RNA-Polymerasen dazu zwang, mit Cas9 so zu kollidieren, dass Cas9 von der DNA abgestoßen wurde.

"Ich war schockiert, dass die Wahl eines DNA-Strangs statt des anderen einen so starken Einfluss auf die Genombearbeitung hatte", sagte Clarke, der Hauptautor des Papiers. "Die Aufdeckung des Mechanismus hinter diesem Phänomen hilft uns besser zu verstehen, wie Cas9-Interaktionen mit dem Genom einige Bearbeitungsversuche zum Scheitern bringen können und dass wir dieses Verständnis bei der Entwicklung eines Genombearbeitungsexperiments zu unserem Vorteil nutzen können".

"Dieses neue Verständnis ist wichtig für diejenigen von uns, die Genombearbeitung benötigen, um gut im Labor zu arbeiten und die Genombearbeitung effizienter und sicherer für zukünftige klinische Anwendungen zu machen", sagte Merrill.

Die Studienergebnisse sind auch deshalb von Bedeutung, weil die Interaktion zwischen Cas9 und dem DNA-Strang nun als "geschwindigkeitsbestimmender Schritt" bekannt ist, so Merrill. Dies bedeutet, dass es der langsamste Teil des Prozesses ist; daher haben Änderungen in dieser Phase das größte Potenzial, die Gesamtdauer der Genombearbeitung zu beeinflussen.

"Wenn wir die Zeit reduzieren können, in der Cas9 mit dem DNA-Strang interagiert, was wir jetzt mit einer RNA-Polymerase tun können, können wir weniger des Enzyms verwenden und die Exposition begrenzen", sagte Merrill. "Das bedeutet, dass wir mehr Möglichkeiten haben, unerwünschte Wirkungen oder Nebenwirkungen zu begrenzen, was für zukünftige Therapien, die sich auf menschliche Patienten auswirken können, unerlässlich ist."

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