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Polymerase-Kettenreaktion



Die Polymerase-Kettenreaktion (englisch Polymerase Chain Reaction, PCR) ist eine Methode, um die Erbsubstanz DNA in vitro zu vervielfältigen, d. h. ohne einen lebenden Organismus wie zum Beispiel das Bakterium Escherichia coli oder die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae zu benutzen. Die PCR wird in biologischen und medizinischen Laboratorien für eine Vielzahl verschiedener Aufgaben verwendet, zum Beispiel für die Erkennung von Erbkrankheiten und Virusinfektionen, für das Erstellen und Überprüfen genetischer Fingerabdrücke, für das Klonieren von Genen und für Abstammungsgutachten.

Inhaltsverzeichnis

Geschichte

Anfang der 1970er Jahre kam der norwegische Postdoc Kjell Kleppe im Labor von Nobelpreisträger Har Gobind Khorana auf den Gedanken, DNA durch zwei flankierende Primer zu vervielfältigen, jedoch geriet die Idee in Vergessenheit.[1] Die Polymerase-Kettenreaktion selber wurde 1983 von Kary Mullis erneut erfunden. Seine Absicht war es ein Verfahren zu entwickeln, das DNA durch wiederholte Verdopplung in mehreren Zyklen mit Hilfe eines Enzyms namens DNA-Polymerase künstlich vervielfältigt. Sieben Jahre, nachdem er seine Idee veröffentlicht hatte, wurde Mullis hierfür 1993 der Nobelpreis für Chemie verliehen.[2]

DNA-Polymerase kommt in allen Lebewesen vor und verdoppelt bei ihnen die DNA vor der Zellteilung. Dazu bindet sie sich an einen einzelnen DNA-Strang und synthetisiert mit Hilfe eines kurzen komplementären Oligonukleotid (Primer) einen dazu komplementären Strang. Bereits in Mullis' ursprünglichem PCR-Versuch wurde das Enzym in vitro verwendet. Die doppelsträngige DNA wurde zunächst durch Erhitzen auf 96 °C in zwei Einzelstränge aufgeteilt. Bei dieser Temperatur wurde die DNA-Polymerase zerstört und musste daher nach jedem Erhitzen erneuert werden. Mullis' ursprüngliches Verfahren war sehr ineffizient, da es viel Zeit, große Mengen DNA-Polymerase und ständige Aufmerksamkeit erforderte.


Später wurde der PCR-Prozess verbessert, indem man die DNA-Polymerase von thermophilen Bakterien verwendete, die z. B. bei über 110 °C in Geysiren leben. Die DNA-Polymerase dieser Lebewesen ist thermostabil und wird daher beim Erhitzen während der PCR-Zyklen nicht zerstört. Da nicht mehr ständig neue DNA-Polymerase hinzugefügt werden musste, konnte der Vervielfältigungs-Vorgang erheblich vereinfacht und automatisiert werden. Eine der ersten thermostabilen DNA-Polymerasen wurde aus Thermus aquaticus gewonnen und wird Taq-Polymerase genannt.

Mullis arbeitete zu dieser Zeit für die Firma Cetus und wurde mit einer Prämie von 10.000 US-Dollar abgefunden. Jahre später verkaufte Cetus dann die Rechte an der PCR-Methode mitsamt dem Patent für die von ihm verwandte DNA-Polymerase Taq an die Firma Roche für 300 Millionen Dollar. Das Enzym Taq wurde bereits 1980 von dem russischen Forscher Kaledin beschrieben. Aus diesem Grund wurde nach jahrelangem Rechtsstreit der Firma Roche das Patent für Taq inzwischen entzogen. Die US-Patente für die PCR-Technologie selber liefen im März 2005 aus.

Die Taq-Polymerase erfährt nach wie vor breite Anwendung. Ihr Nachteil liegt darin, dass sie manchmal Fehler beim Kopieren der DNA produziert, was zu Mutationen in der DNA-Sequenz führt. Polymerasen wie Pwo und Pfu, die aus Archaea gewonnen werden, haben einen Korrektur-Mechanismus, der die Anzahl der Mutationen in der kopierten DNA erheblich senkt.

PCR in der Praxis

  PCR wird eingesetzt um einen kurzen, genau definierten Teil eines DNA-Strangs zu vervielfältigen. Dabei kann es sich um ein Gen oder auch nur um einen Teil eines Gens handeln oder auch um nicht kodierende DNA-Sequenzen. Im Gegensatz zu lebenden Organismen kann der PCR-Prozess nur relativ kurze DNA-Abschnitte kopieren. Bei einer Standard-PCR können dies bis zu etwa 3.000 Basenpaare (3 kbp) lange DNA-Fragmente sein. Mit Hilfe bestimmter Polymerasen-Gemische, weiterer Additive in der PCR-Reaktion und optimalen Bedingungen können sogar Fragmente mit einer Länge von über 20-40 kbp vervielfältigt werden, was immer noch sehr viel kürzer ist als die chromosomale DNA einer eukaryotischen Zelle. Das menschliche Genom enthält beispielsweise etwa drei Milliarden Basenpaare.

In ihren momentanen Anwendungsgebieten benötigt PCR mehrere grundlegende Komponenten. Diese sind:

  • Die Original-DNA, die den zu vervielfältigenden Abschnitt enthält
  • Zwei Primer, um auf den beiden Einzelsträngen der DNA jeweils den Startpunkt der DNA-Synthese festzulegen, wodurch der zu vervielfältigende Bereich von beiden Seiten begrenzt wird.
  • DNA-Polymerase, die bei hohen Temperaturen nicht zerstört wird, um den festgelegten Abschnitt zu replizieren (kopieren) (z. B. Taq-Polymerase)
  • Desoxynukleosidtriphosphate, die Bausteine für den von der DNA-Polymerase synthetisierten DNA-Strang
  • Mg2+-Ionen, für die Funktion der Polymerase essentiell
  • Pufferlösungen, die eine für die DNA-Polymerase geeignete chemische Umgebung sicherstellen

Die Polymerase-Kettenreaktion findet in einem so genannten Thermocycler statt. Diese Maschine erhitzt und kühlt die in ihr befindlichen Reaktionsgefäße präzise auf die Temperatur, die für den jeweiligen Schritt benötigt wird. Um Verdunstung zu verhindern, wird ein dicht schließendes Reaktionsgefäß oder eine Ölschicht auf dem Reaktionsgemisch verwendet. Etwaige Kondesatbildung im Deckel des Gefäßes wird durch einen beheizbaren Gerätedeckel (über 100 °C) verhindert.

Soll die PCR vor allem als quantitativer Nachweis dienen, empfiehlt sich die sog. Real Time PCR.

Die Verwendung einer Pyrophosphatase kann unter Umständen die Effektivität der PCR steigern. Das Enzym katalysiert die Hydrolyse des von den Nukleotidtriphosphaten abgespaltenem Pyrophosphat zu Orthophosphat. Pyrophosphat kann als Inhibitor bei der PCR wirken.

Ablauf

Der PCR-Prozess besteht aus einer Anzahl von 25 bis 50 Zyklen, die in einem Thermocycler durchgeführt werden. Jeder Zyklus besteht aus drei Schritten (siehe Abbildung unterhalb):

  1. Denaturierung (o. a. Melting, Schmelzen): Zunächst wird die doppelsträngige DNA auf 94-96 °C erhitzt, um die Stränge zu trennen. Die Wasserstoffbrückenbindungen, die die beiden DNA-Stränge zusammenhalten, werden aufgebrochen. Im ersten Zyklus wird die DNA oft für längere Zeit erhitzt, um sicherzustellen, dass sich sowohl die Ausgangs-DNA als auch die Primer vollständig voneinander getrennt haben und nur noch Einzelstränge vorliegen.
  2. Primerhybridisierung (primer annealing): Nach der Trennung der Stränge wird die Temperatur gesenkt, so dass die Primer sich an die einzelnen DNA-Stränge anlagern können. Die Temperatur während dieser Phase hängt von den Primern ab und liegt normalerweise 2-3 °C unter ihrem Schmelzpunkt, typischerweise zwischen 50 °C und 65 °C. Wird die Temperatur falsch gewählt, kann das dazu führen, dass die Primer sich nicht (Temperatur zu hoch) oder an falschen Stellen (Temperatur zu niedrig) an der Ausgangs-DNA anlagern.
  3. Elongation (Polymerisation, Verlängerung): Schließlich füllt die DNA-Polymerase die fehlenden Stränge mit freien Nukleotiden auf. Sie beginnt am 3'-Ende des angelagerten Primers und folgt dann dem DNA-Strang. Der Primer wird nicht wieder abgelöst, da er den Anfang des Einzelstrangs bildet. Die Temperatur hängt nun von der verwendeten DNA-Polymerase ab (zwischen 68 °C und 72 °C); die Zeit, die dieser Schritt benötigt, hängt ebenfalls von der verwendeten DNA-Polymerase und der Länge des DNA-Fragments, das vervielfältigt werden soll ab.


 

Die entstandene DNA verdoppelt sich mit dem nächsten Zyklus, allerdings entsteht mit diesem weitere Ziel-DNA aus dem Ausgangsmaterial sowie den entstandenen Teilstücken, dies führt zu einem exponentiellen Anstieg der gewünschten Ziel-DNA. Dieser Anstieg ist gegenüber dem linearen Anstieg der nicht weiterzuverwendenden entstandenen Teilstücke soviel größer, dass das Verhältnis von Ziel-DNA zu diesen nach einigen Zyklen bereits so groß ist, dass bei der Probenentnahme mit großer Wahrscheinlichkeit eine große Menge Ziel-DNA enthalten sein wird.

Beispiel

Als allgemeines Beispiel sei hier die „Rezeptur“ für eine PCR-Reaktion wiedergegeben (viele Beispiele für die verschiedensten Reaktionen finden sich ansonsten in der wissenschaftlichen Literatur in allen möglichen Variationen):

1,0 µl DNA-Vorlage (100 ng/µl)
2,0 µl pro Primer (10 µM)
1,0 µl Pfu-, Taq- oder andere thermostabile Polymerase (1-5 U/µl)
1,0 µl 10 mM Desoxy-Nukleotide (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), „dNTP“
5,0 µl 10-fach konzentrierte Polymerase-Pufferlösung
38,0  µl H2O

50,0 µl Gesamtvolumen

Ein 200 µl-Reaktionsgefäß mit den 50 µl Gemisch wird in den Thermocycler gestellt.

Schritte des PCR-Prozesses

  Die folgenden Angaben sind als Richtwerte gedacht. Meist muss eine PCR auf die spezifische Reaktion hin optimiert werden. Für eine normale Präparation eines Amplifikats reicht folgendes Programm aber aus:

  1. Initialisierung. Das Gemisch wird ca. 2 Minuten lang auf 96 °C erhitzt, um sicherzustellen, dass sich die DNA-Doppelstränge getrennt haben. Manche (sogenannte hot start-) Polymerasen müssen auch durch eine noch längere anfängliche Erhitzungs-Phase (bis zu 15 Minuten) erst aktiviert werden.
  2. Denaturierung. Die Temperatur ca. 30 Sekunden lang auf 96 °C halten. Das genügt gewöhnlich, um die DNA während der Zyklen zu denaturieren.
  3. Anlagerung (annealing). Die Temperatur ca. 30 Sekunden lang auf einer Temperatur halten, die eine spezifische Anlagerung der Primer an die DNA erlaubt. Die genaue Temperatur wird hierbei durch die Länge und die Sequenz der Primer bestimmt (bzw. der passenden Nukleotide im Primer, wenn durch diesen Mutationen eingeführt werden sollen = site-directed Mutagenesis). Wird die Temperatur zu niedrig gewählt, können sich die Primer u. U. auch an nicht 100%-komplementären Sequenzen anlagern und so zu unspezifischen Produkten („Geisterbanden“) führen. Wird die Temperatur zu hoch gewählt, ist die thermische Bewegung der Primer u. U. so groß, dass sie sich nicht richtig anheften können, so dass es zu gar keiner oder nur ineffizienter Produktbildung kommt. Meist liegt die Temperatur bei 55 °C bis 65 °C.
  4. Verlängerung (elongation). Die Temperatur für ca. 30 Sekunden je 500 Basenpaare auf 68-72 °C (je nach Polymerase) halten.
    Die Schritte 2-4 werden 25-40 mal wiederholt.
  5. Das Gemisch wird bei 4-8 °C aufbewahrt. Man kann die PCR am Abend vor dem Verlassen des Labors einleiten, so dass sie über Nacht läuft. Die DNA wird bei 4-8 °C nach nur einer Nacht nicht beschädigt.

Das PCR-Produkt kann durch Agarose-Gelelektrophorese anhand seiner Größe identifiziert werden. (Die Agarose-Gelelektrophorese ist ein Verfahren, bei der DNA in ein Agarose-Gel eingebracht wird und anschließend eine Spannung angelegt wird. Dann bewegen sich die kürzeren DNA-Stränge schneller als die längeren auf den Pluspol zu.) Die Menge des PCR-Produkts kann durch einen Vergleich mit einer DNA-Leiter, die DNA-Fragmente bekannter Größe enthält und parallel zur Probe im Gel mitläuft, bestimmt werden.

PCR-Anwendungsgebiete

Die PCR kann für eine Vielzahl von Experimenten und Analysen eingesetzt werden, einige Beispiele werden weiter unten vorgestellt.

Genetischer Fingerabdruck

Der genetische Fingerabdruck wird in der Gerichtsmedizin zur Identifizierung einer Person eingesetzt, indem seine oder ihre DNA mit einer vorhandenen Probe verglichen wird. Beispielsweise kann eine Blutprobe von einem Tatort mit dem Blut eines Verdächtigen verglichen werden. Die Probe kann minimal sein, das heißt, eine einzige Zelle (in deren Zellkern die DNA ist) genügt. An Tatorten findet man meistens Blut, Sperma, Speichel, Haut, Haare oder ähnliche Zellen (Speichel und Haare enthalten zwar keine Zellkerne, jedoch sind im Speichel meist Zellreste zu finden, an Haaren oft die Haarwurzeln). Theoretisch genügt ein einziger Strang. Zuerst spaltet man die DNA-Probe in Fragmente auf, die dann mittels PCR vervielfältigt werden. Die vervielfältigten Fragmente werden anschließend durch Gelelektrophorese getrennt. Die so gewonnene Anordnung der DNA-Fragmente nennt man DNA-Fingerabdruck. Diese Fragmente enthalten jedoch größtenteils polymorphe Bereiche. Das sind sich wiederholende DNA-Abschnitte im nicht kodierenden Bereich der DNA (junk DNA), sogenannte repetetive Sequenzen. Diese Sequenzen liegen zwischen den Genen. Deshalb lässt sich anhand des genetischen Fingerabdrucks keine Disposition feststellen.

Vaterschaftstest

  Obwohl diese erzeugten „Fingerabdrücke“ einzigartig sind (bei eineiigen Zwillingen sind sie nahezu identisch; Unterschiede können hier nur mit zusätzlichem Aufwand nachgewiesen werden), können genetische Beziehungen, zum Beispiel zwischen Eltern und Kindern oder zwischen Geschwistern durch zwei oder mehr genetische Fingerabdrücke bestimmt werden, was bei Vaterschaftstests zum Einsatz kommt (Abb. 3). Eine Abwandlung dieser Technik wird auch zur Bestimmung evolutionärer Beziehungen zwischen Organismen angewandt.

Erkennung von Krankheiten

Die Erkennung von Erbkrankheiten in einem vorliegenden Genom ist ein langwieriger und komplizierter Vorgang, der durch den Einsatz von PCR bedeutend verkürzt werden kann. Jedes Gen, das in Frage kommt, kann durch PCR mit den entsprechenden Primern amplifiziert (= vervielfältigt) und anschließend sequenziert werden (DNA sequenzieren heißt, die Sequenz der Nukleotide (oder Basen) der DNA zu bestimmen), um Mutationen aufzuspüren.

Virale Erkrankungen können ebenfalls durch PCR erkannt werden, indem man die Virus-DNA vervielfältigt bzw. bei RNA-Viren diese RNA erst in DNA umschreibt und dann mittels PCR vervielfältigt (die RT-PCR). Diese Analyse kann sofort nach der Infektion erfolgen, oft Tage oder Wochen vor dem Auftreten der Symptome. Erfolgt die Diagnose so früh, erleichtert das den Medizinern die Behandlung erheblich.

Die PCR kann auch zu Reihenuntersuchungen eingesetzt werden. So wird sie z. B. von Blutspendediensten zur Routineuntersuchung von Blutkonserven eingesetzt. Durch die frühestmögliche Entdeckung einer gefährlichen Infektionskrankheit beim Spender (z. B. HIV, Hepatitis B) kann das sog. diagnostische Fenster nahezu geschlossen werden. Durch die Empfindlichkeit der PCR-Tests ist es möglich, Proben in sog. Pools (z. B. 96 Einzelproben) zusammenzufassen. Wird ein Pool positiv getestet, wird seine Größe solange verkleinert (meistens halbiert), bis die verursachende Probe gefunden ist.

Klonierung von Genen

Das Klonieren eines Gens - nicht zu verwechseln mit dem Klonen eines ganzen Organismus - ist ein Vorgang, bei dem ein Gen aus einem Organismus isoliert und anschließend in einen anderen eingepflanzt wird. PCR wird oft benutzt, um das Gen zu vervielfältigen, das dann in einen Vektor (ein Vektor ist ein Mittel, mit dem ein Gen in einen Organismus verpflanzt werden kann), beispielsweise ein Plasmid (ein ringförmiges DNA-Molekül), eingefügt wird (Abb. 4). Die DNA kann anschließend in einen anderen Organismus eingesetzt werden, in dem das Gen oder sein Produkt besser untersucht werden kann. Das Exprimieren eines klonierten Gens kann auch zur massenhaften Herstellung nutzbarer Proteine wie z. B. Arzneimittel dienen.

 

Mutagenese

Mutagenese ist eine Möglichkeit, die Sequenz der Nukleotide (Basen) der DNA zu verändern. Es gibt Situationen, in denen man mutierte (veränderte) Kopien eines bestimmten DNA-Strangs benötigt, um die Funktion eines Gens zu bestimmen. Mutationen können in kopierte DNA-Sequenzen auf zwei grundsätzlich verschiedene Arten während des PCR-Prozesses eingefügt werden.

Gezielte Mutagenese (z. B.: “site-directed mutagenesis”) erlaubt es dem Forscher, an spezifischen Stellen auf dem DNA-Strang Mutationen zu erzeugen. Meist wird dafür die gewünschte Mutation in die Primer integriert, die für die PCR verwendet werden. Bei der gezielten bzw. stellenspezifischen Mutagenese ist mindestens einer der Primer nicht 100prozentig identisch mit der DNA an die er sich anlagert. Während der Amplifikation wird so eine Mutation in das DNA-Fragment eingeführt.

Zufällige Mutagenese (“random mutagenesis”) beruht hingegen auf der Verwendung von fehlerträchtigen Polymerasen (bzw. Polymerasen ohne Mechanismus zur Fehlerkorrektur) während des PCR-Prozess. Bei der zufälligen Mutagenese können Ort und Art der Mutationen nicht beeinflusst werden und müssen erst durch eine Sequenzierung identifiziert werden.

Eine Anwendung der zufälligen oder gezielten Mutagenese ist die Analyse der Struktur-Funktions-Beziehungen eines Proteins. Nach der Veränderung der DNA-Sequenz kann man das entstandene Protein mit dem Original vergleichen und die Funktion aller Teile des Proteins bestimmen. Weiterhin können damit auch Funktionen der Nukleinsäure selbst (mRNA-Transport, mRNA-Lokalisation, etc.) untersucht werden.

Analyse alter (fossiler) DNA

Da die PCR aus nur geringen DNA-Probemengen eine beliebige Menge von Material erzeugen kann, ist sie besonders für die sehr alte aDNA geeignet, die in der Natur nur noch in für Untersuchungen nicht mehr ausreichenden Mengen vorkommt. Dabei beruhen nahezu alle wissenschaftlichen Erkenntnisgewinne in Bezug auf die aDNA und somit viele seit langem ausgestorbener Arten auf der Methode der PCR.

Geschlechtsbestimmung

Die PCR kann eingesetzt werden, um Material für einen Nachweis der geschlechtsspezifischen Chromosomen zu gewinnen. Das ist bei den üblichen Haussäugetieren nicht üblich, außer eventuell bei Zwittern. Bei manchen Tieren im Zoo, besonders aber bei Vögeln, Reptilien oder Fischen, ist es die schonendste und sicherste Variante. Im Heimtierbereich ist diese PCR Methode bei Papageien üblich.

Quellen

  1. Kleppe, K. et al. (1971): Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases. In: J. Mol. Biol. Bd. 56, S. 341-361. PMID 4927950
  2. Informationen der Nobelstiftung zur Preisverleihung 1993 an Kary B. Mullis (englisch)

Literatur

Zu PCR (Polymerase-Kettenreaktion):

  • C. R. Newton, A. Graham: PCR. Introduction to Scientific Techniques. 2d. ed. BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford 1997. ISBN 1-872748-82-1
  • R. K. Saiki, D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, H. A. Erlich. Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase. in: Science. 239.1988, 487–491. ISSN 0036-8075 PMID: 2448875
  • Mullis: System for automated performance of the polymerase chain reaction. United States Patent 5,656,493, August 12, 1997.
  • Rabinow, Paul: Making PCR: A Story of Biotechnology, University of Chicago Press, 1996. ISBN 0-226-70146-8

Zum Genetischen Fingerabdruck (Genetic Fingerprinting):

  • J. Ballantyne (Hrsg.): DNA Technology and Forensic Science. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY 1989. ISBN 0-87969-232-4
  • P. R. Billings (Hrsg.): DNA on Trial. Genetic Identification and Criminal Justice. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY 1992. ISBN 0-87969-379-7
  • R. K. Saiki, S. Scharf, F. Faloona, K. B. Mullis, G. T. Horn, H. A. Erlich, N. Arnheim: Enzymatic Amplification of Beta-Globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle-Cell Anemia. in: Science. 230.1985, 1350–1354. ISSN 0036-8075

Siehe auch

 
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