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Probenaufreinigung im Zeichen der Zeit
Flash-chromatographische Trennung von Lipiden und Peptiden auf RediSep Fertigkartuschen

Dr. Maria-Anca Briese, Axel Semrau GmbH & Co. KG

Automatische Multisäulen-Flash-Anlagen sind in der Lage, ohne Aufsicht mehrere hundert Verbindungen am Tag über parallel oder sequentiell verlaufende Trennungen zu reinigen.

Diese modernen Flash-Anlagen betreibt man mit fertig gepackten Kartuschen, die ein geeignetes Werkzeug darstellen, um schnell entsprechende Zielverbindungen zu isolieren. Das Flash-Kieselgel mit 35-60 µm Partikelgröße (230-400 mesh) und 100 Å Porengröße ermöglicht über Dipol-Dipol-Wechselwirkungen und Wasserstoffbrücken eine schnelle Isolierung der Wirkstoffe. Substanzmengen im Milligramm- bis Grammbereich lassen sich in weniger als 15 Minuten trennen. Die erzielbare Reinheit liegt bei 80 bis 90%. Das ist üblicherweise ausreichend um beispielsweise in der Initialphase der Entwicklung von Arzneistoffen therapeutische Aktivitäten nachzuweisen. Fertigkartuschen gibt es auch mit Reversed-Phase (C18), Alumina, Florisil und endgruppenmodifizierten (Amino-, Fluoro-, Cyano- und Diol-) Phasen und Ionenaustauschern (SCX und SAX) in verschiedenen Größen vorgepackt. Hiermit gelingt die schnelle reproduzierbare Aufreinigung einer Vielzahl verschiedener Substanzenklassen.

Die hohe Trennleistung der RediSep Fertigkartuschen (Teledyne ISCO) basiert auf dem sehr homogenen und stabilen Säulenbett und wird am Beispiel einer Lipidtrennung (Normal-Phase) und einer Peptidtrennung (Reversed-Phase) gezeigt. Die flash-chromatographischen Trennungen sind mit Hilfe des vollautomatischen CombiFlash-Systems Companion (Teledyne ISCO) durchgeführt worden.

Die Aufreinigung der Lipidmischung (unpolare-, Glyko- und Phospholipide), die normalerweise schwierig und arbeitsaufwendig ist, konnte durch eine dynamische Änderung der Trennbedingungen (Methodenentwicklung) einfach durchgeführt werden. Die Probe (1 g) wurde mit einer 40 g Kartusche mit Hexan und Ethylacetat bei einer Flussrate von 30 ml/min getrennt und bei 254 nm detektiert. Um die Trennleistung zu erhöhen, wurde die Kartusche vor der Trennung mit den Startbedingungen konditioniert. Die Auflösung der drei Komponenten (Peaks) ist durch Verwendung einer Gradientenelution verbessert und die Laufzeit verkürzt worden. Leicht geänderte lineare Gradientenprofile (Punktlinie in Abbildung 1) erzielten hervorragende Ergebnisse. Abbildung 1 zeigt die optimierte Flashtrennung einer Lipidmischung.

Abbildung 1: Trennung einer Lipidmischung auf NP RediSep Kartuschen.

Peak 1 und 2 bilden je ca. 25% und Peak 3 ca. 50 % der gesamten Peakfläche. Die Laufzeit konnte noch verkürzt werden, da die Trennung (Abbildung 1) innerhalb von 20 Minuten erfolgreich abgeschlossen wurde. Dadurch erzielt man Kostensenkungen (Einsparung von Lösungsmitteln und Lösungsmittel-Entsorgungskosten) und erhöht die Produktivität (Zeitersparnis).

Die Aufreinigung von Peptiden ist eine zeitaufwendige Aufgabe. Peptide (Aminosäuren-Polymere) sind relativ polar. Standard-Trennbedingungen für Peptide sind wiederverwendbare C18 Reversed-Phasen und das Laufmittel Wasser (0,1% TFA) und Acetonitril (0,1% TFA). Die Trennleistung der 4,3 g C18 RediSep Kartusche bei einer Beladung von 0,1% (v/v) Probe ist durch eine Konditionierung der Kartusche wesentlich verbessert worden. Da viele Peptide meistens mit der stationären Phase in starke Wechselwirkungen treten, ist es von großer Bedeutung, die C18 Phase vor der Trennung richtig zu benetzen. Bei einem linearen Gradientenprofil (0-95%) und eine Flussrate von 17 ml/min ist die Trennung innerhalb von 9 Minuten (ohne Konditionierung der Kartusche) erfolgreich abgeschlossen worden.

Die optimale Wellenlänge der Bestimmung ist durch eine schnelle Methodenentwicklung ermittelt worden, da die Anlage über einen variablen UV-Detektor (Diodenarray-Technologie) für den Bereich 200 - 360 nm verfügt. Da aromatische Kohlenwasserstoffe optimal bei 280 nm, Doppelbindungen bei 254 nm und Einfachbindungen bei 210 nm detektiert werden, ist die höchste Empfindlichkeit für die Peptidtrennung trotz etwas unruhiger Basislinie bei 210 nm erreicht worden. Abbildung 2 zeigt das Chromatogramm der Peptidtrennung.

Abbildung 2: Trennung von Peptiden auf RP RediSep Kartuschen.

Ein reproduzierbares Upscaling ist mit der zehnfachen Probenmenge auf einer 43g RediSep Kartusche durchgeführt worden. Die Beladungskapazität der RediSep Kartuschen liegt zwischen ca. 0,1 bis 10% ihres Packungsgewichtes.

Zusammenfassung
Neue Syntheseformen und Strategien in der forschenden chemischen Industrie verlangen flexible, moderne Reinigungssysteme für die in großer Anzahl entstandenen Substanzen. Dieser Bedarf hat zur Entwicklung von Flash-Reinigungsanlagen und Einweg-Kartuschen geführt, die den Engpass in der Probenreinigung beseitigen. Im Vergleich zu selbstgepackten Kieselgelsäulen garantieren fertiggepackte Kartuschen eine gleichmäßige Reproduzierbarkeit und hohe Produktreinheit. RediSep Kartuschen erhöhen durch ein gleichmäßiges und kompaktes Säulenbett den Durchsatz, die Geschwindigkeit und die Qualität der Trennung.